שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.
Abstract
יצירת זרע הוא הפיתוח של spermatogonia לתוך spermatozoa בוגרת ב בקוריאנית וכמה של בזרמה. תהליך זה נתמך על ידי צמתי תא סרטולי-מחסום דם-testis (BTB), אשר היא המכשול הכי צפופה רקמות בגוף יונקים segregates האפיתל וכמה לתוך שני תאים, על הבסיס של adluminal. BTB יוצרת microenvironment ייחודי בתאי הנבט, מיוזה אני / II ועל ההתפתחות של postmeiotic spermatids לתוך spermatozoa דרך spermiogenesis. כאן, אנו מתארים וזמינותו אמין כדי לפקח BTB שלמות של העכבר testis ויוו. BTB שלם חוסם פעפוע של FITC מצומדת אינולין מן הבסיס כדי תא הפסגה של בקוריאנית וכמה. טכניקה זו מתאימה ללמוד מועמדים הגן, וירוסים או חשיפה לרעלים סביבתיים שעשויים להשפיע על תפקוד BTB או תקינות, עם הליך קל, דרישה מינימלית של היכולות הכירורגיים לעומת שיטות אלטרנטיביות.
Introduction
בתרבית של יצירת זרע נחשב תהליך מובנה מאוד שמקיף התחדשות עצמית spermatogonial ובידול דרך spermatocytes לתוך spermatozoa הפלואידי באמצעות מיטוזה, מיוזה, spermiogenesis, שבמהלכו דרמטי שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים להתרחש. מתפתחות בתאי הנבט מועברים בהדרגה מבסיס של צנורית וכמה לכיוון לומן. תהליך זה מוסדר על ידי תאים תאים הקשר בין בתאי הנבט סרטולי תאים1,2. התאים Sertoli הסמוכים טופס BTB הממוקמת ליד בסיס צנורית וכמה. BTB מחלק פיזית האפיתל של הבסיס, תא של adluminal. בשלבים השמיני – התשיעי של מחזור אפיתל, preleptotene/leptotene spermatocytes מן התאים הבזליים לנדוד בין BTB, להזין את התאים adluminal3. לכן, תפקוד BTB נועד לספק של microenvironment immunoprivileged להשלמת מיוזה, spermiogenesis4,5,6. בניגוד רקמות דם מכשולים אחרים (למשל, מחסום הדם – מוח) רק המורכבות צמתי צר (TJs), BTB נוצרת על ידי ארבעה צמתים שונים (TJs מתמחה רוחות, הפער צמתי, ביניים מבוסס-פילמנט desmosomes) בין סרטולי תאים1,7.
מחקרים רבים השתמשו מהונדס גנטית עכברים הידבקות בווירוסים, חשיפה לרעלים סביבתיים כדי לחקור מנגנונים של BTB שלמות7,8,9. השיבוש BTB מעוררת יצירת זרע לקוי ולא subfertility או אי פוריות. מאז היווצרות BTB ותקינות אושרו להיות מושפעות מגעים בין תאי סרטולי8, במבחנה מודל המבוסס על תרבות העיקרי של תאי סרטולי מבודד שימש למחקר BTB. עם זאת, מודל זה במדויק לא יכול לחקות BTB dynamics vivo בתוך. יתר על כן, אין תרבות משותפת כזו תאי נבט עם תאי סרטולי נוצרה כמו מסוגל המשקף את כל הרכיבים פונקציונלי מבניים הרלוונטיים של ה BTB10,11.
באופן כללי, אין ויוו מבחני יושרה BTB מבוססים בדרך כלל על מולקולות קטנות, כגון EZ-קישור Sulfo-NHS-LC-ביוטין, אינולין FITC מצומדת (אינולין-FITC). בדרך כלל, פעפוע של ביוטין או אינולין-FITC מן התא הבסיס חסומה על-ידי BTB מבנה. לכן, אנו מסוגלים להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את היקף הנזק BTB לעומת קבוצות שליטה. בעוד BTB יכול להיות בסכנה עם סוגים מסוימים של גירויים, כגון טיפול עם קדמיום כלוריד (CdCl2)12, BTB הופך נגיש מולקולות קטנות, אשר בסופו של דבר הזן תא adluminal מחוונים.
מוקדם ויוו BTB שלמות assay המוחלשים ביוטין או אינולין-FITC לתוך ומוחלף על, אשר כרוך הניתוח, היא פולשנית, מסובך, גוזלת זמן. חוץ מזה, כל החומרים כתב מפוזרת באמצעות הגוף כולו דרך מחזור הדם, הריכוז המקומי של ביוטין או אינולין-FITC ב בקוריאנית וכמה הוא מוגבל. יתר על כן, חשיפה מערכתית עלול לגרום לתגובות החיסון. כאן, אנו מציגים פשוטה ויעילה ויוו BTB שלמות assay הפעלת הזרקה ישירה של aliquot קטן של אינולין-FITC לתוך interstitium של מבחן. שימוש של פלורסנט שיטת תיוג, התהליך מכתימים הוא נוח, כמו נוגדנים משניים אינם נדרשים. כאן, התהליך של הפלורסנט הזנת בזרמה הוא מדמיין.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת זרע לוקח מקום האפיתל וכמה, הוא תהליך מאוד מסודר ודינמי נשלטת על ידי בתאי הנבט ותאים סומטיים (למשל, התאים Sertoli)13. המבנה BTB, אשר נבנה על ידי תאי סרטולי, מחלק וכמה האפיתל של הבסיס, תא של הפסגה. הפיתוח של meiotic, הפלואידי בתאי הנבט מתרחשת בתוך התא הפסגה המהווה מכשול אימונו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך על ידי ה-R המפתח הלאומית & D התוכנית של סין (2016YFA0500902), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31471228, 31771653), קרן המדע ג’יאנגסו עבור חוקרים צעירים מכובד (BK20150047), מדעי הטבע קרן של מחוז ג’יאנגסו (BK20140897, 14KJA180005), התוכנית יזמיים וחדשניים של מחוז ג’יאנגסו אל K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
