Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

Mammalian клетки подвергаются механические, осмотического и биохимических стресс, что приводит к потере целостности плазматической мембраны. Без быстрого и эффективного запечатывания, поврежденные клетки быстро будет поддаваться запрограммирован или некротической смерти. С 1960 года усилия, чтобы понять плазматической мембраны, запечатывания процесса были вызваны разрушительные последствия, связанные с его дисфункции. Действительно заболеваний, таких как конечности-ремень мышечной дистрофии, сахарный диабет, Синдром Чедиака-Хигаси были связаны с недостатками плазматической мембраны ремонт из-за мутации гена кодирования dysferlin, производство Расширенный гликирования конечных продуктов и дефекты в лизосомальных людьми регулятор CHS1, соответственно^1,2,3,4,5,6. Однако на сегодняшний день, наше понимание мембраны запечатывания является еще ограничен⁷. Первоначальные исследования показали, что мембрана запечатывания инициируется приток внеклеточного Ca^{2 +} через повреждения плазматической мембраны^8,9,10. С тех пор нескольких не являющихся взаимоисключающими Ca^{2 +}-зависимых механизмов были предложены для запечатывания ячейки. Гипотеза патч предлагает, что в близости от раны, внутриклеточных везикулы сливаются друг с другом и повреждения плазматической мембраны в качестве патч^11,12,,1314. Вторая модель предлагает что экзоцитоз кальций зависимых от лизосомы на рану сайт выпускает лизосомальных ферментов кислоты sphingomyelinase, который преобразует сфингомиелин Церамид в наружный листок плазматической мембраны. Это внезапное изменение в липидного состава приводит к инициативе Церамид эндоцитоза поврежденные региона^15,16,17. Наконец третий предложенный механизм включает в себя роли для от англ сортировочный комплекс необходимых для транспорта (ESCRT) для поощрения формирования выходят на внешнюю сторону пузырьки, которые бутон от плазматической мембраны¹⁸. Только ограниченный набор белков была определена в этих моделях, и их оборудование должны далее осветил.

Здесь мы описываем пробирного высокой пропускной способности, что меры плазматической мембраны, запечатывания эффективность адэрентных клеток млекопитающих подвергается повреждению при посредничестве рекомбинантных листериолизин O (LLO)¹⁹. LLO поры формирование токсин (PFT) выделяется факультативная внутриклеточных патогенов Listeria monocytogenes^20,,2122 и принадлежит к MACPF/CDC (комплекс нападения мембраны, Перфорины, и холестерин зависимой cytolysin) надсемейства. MACPF являются млекопитающих формирование пор белков, участвующих в иммунной защиты, тогда как СРНП в основном являются бактериальные токсины, производимые грамположительных возбудителей, которые повреждают клетки хозяина для содействия их патогенного образ жизни²³. СРНП синтезируются как водорастворимые мономеров или димеры, привязанные к холестерина в плазматической мембраны и oligomerize в prepore комплекс до 50 подразделений. Комплекс prepore затем переставляет вставлять β-нити через липидный бислой, формируя поры β-ствол, который охватывает 30-50 Нм в диаметр^24,25,,2627.  Эти большие поры позволяют флюсы ионов и малые клеточных компонентов и выход из клетки; Хотя некоторые исследования предложили, что поры меньших размеров, также сформированного^28,29,30. Среди CDCs LLO отображает уникальные свойства, включая необратимым рН и температуры зависит от агрегации, который способствует высокой пропускной способности анализа^31,32. LLO могут быть добавлены в среде культуры клеток на 4 ° c, температура разрешительной для его привязки к клеткам, но не в формировании порового комплекса. Начало порообразования затем могут быть синхронизированы с повышения температуры до 37 градусов, позволяя для эффективного распространения молекул токсина в плоскости мембраны к форме олигомеров и конформационные Ремоделирование участвующих в поры поколения. Поэтому следуя переключатель температуры, кинетическая повреждения клеток будет зависеть количество токсина, привязан к плазматической мембраны. Главное растворимых лло (не привязан к плазматической мембраны) быстро и необратимо агрегатов, когда температура достигает 37 градусов, который избавляет от необходимости смывать несвязанных токсин молекул и ограничивает степень повреждения мембраны с течением времени. И наконец потому что LLO связывает холестерин и формирует поры мембраны холестерина-богатые люди, этот assay поддается широкий спектр mammalian клеток. Это важно иметь в виду, что LLO влияет на клетки-хозяина сигнализации главным образом через порообразования, за некоторыми исключениями, в котором поры независимые ячейки сигнализации может произойти^{33,34,35,36 ,37,,3839}. Таким образом, он не может быть исключено что LLO сигнализации деятельность может повлиять на процесс ремонта мембраны.

Этот assay непосредственно оценивает степень клеток ранив путем измерения включение клетки impermeant флюрохром, (например, пропидий йодидом) которая пассивно входит раненых клетки и становится весьма флуоресцентные, когда он ассоциируется с нуклеиновыми кислотами . Таким образом флюрохром может быть сохранен в среде культуры клеток на протяжении эксперимента, что позволяет в реальном времени анализ клеток ранив. Интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот связывание красителя будет возрастать концентрация токсина и для заданной концентрации токсина, будет возрастать с течением времени до тех пор, пока все поры образуются, а клетки полностью отремонтированы или пока не достигнут насыщения. Приток внеклеточного Ca^{2 +} через поры мембраны является событием sine qua non для запечатывания. Таким образом, закрытия эффективности может быть косвенно подтверждается сравнения клеток, ранив в питательной среды, содержащие Ca^{2 +} (ремонт разрешительной условие) до ранения в Ca^{2 +}-бесплатный среднего (ремонт ограничительное условие). Потому что интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот связывание красителя прямо пропорциональна концентрации клеток в каждой скважине, важно для клеток семян на такой же концентрации на всех скважинах. Важно также для перечисления клеток в каждой скважине до и после assay чтобы отряд ячейки не происходит, как плавающие, агрегированные клетки могут скрывать флуоресценции чтений, которые могут затруднить интерпретацию данных. Для перечисления клетки, клетки, выражая-локализованных гистона 2B-GFP (H2B-GFP) были использованы в этом assay. Контролем температуры, мульти-режим, Гонав читателей объединить быстрой и высок объём измерения (используя формат 96 или 384-ну пластины) интенсивностью флюоресценции с микроскопии изображений живых клеток на 37 ° C. Последний может использоваться для перечисления количества клеток и наблюдать возможного формирования различных клеточных популяций.

В конечном счете этот assay предоставляет пользователям возможность расширить свои знания о сложности ремонта мембранных механизмов путем скрининга для принимающих молекул или ремонта экзогенно добавил соединений, которые может контролировать мембраны. Следующий протокол описывает экспериментальные шаги для определения эффективности закрытия клеток подвергается LLO и оценить последствия данного препарата или сотовой лечения по эффективности закрытия.