Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Células de mamíferos estão sujeitos a estresse mecânico, osmótico e bioquímico, resultando na perda da integridade da membrana plasmática. Sem rápida e eficiente de fechamento, células danificadas rapidamente iria sucumbir à morte programada ou necrótica. Desde a década de 1960, os esforços para compreender a membrana de plasma nesse processo tem sido motivados pelas consequências devastadoras associadas com suas disfunções. Na verdade, doenças como Distrofia Muscular de membro-cinta, diabetes e síndrome de Chediak-Higashi têm sido associadas a reparação da membrana de plasma deficiente devido a mutações no gene dysferlin codificação, produção de produtos finais de glicação avançada e defeitos em o regulador de tráfico dos lisossomos CHS1, respectivamente,^1,2,3,4,5,6. No entanto, até à data, nossa compreensão da membrana de fechamento é ainda limitado⁷. Os estudos iniciais demonstraram que a membrana recelagem é iniciada pelo influxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana de plasma danificado^8,9,10. Desde então, vários não mutuamente exclusivas Ca^{2 +}-dependentes mecanismos têm sido propostos para selar as células. A hipótese de remendo propõe que no próximo a ferida, intracelulares vesículas fundem-se com os outros e a membrana plasmática danificada para atuar como um patch^11,12,13,14. Um segundo modelo propõe que exocitose de cálcio-dependente de lisossomos para a ferida local libera a enzima lisossomal sphingomyelinase ácido, que converte esfingomielina, a ceramida no folheto externo da membrana plasmática. Esta súbita mudança na composição de lipídios resulta em endocitose ceramida-conduzido a região danificada^15,16,17. Por último, o terceiro mecanismo proposto envolve um papel para o CDDP classificação complexa necessária para o transporte (ESCRT) promover a formação de vesículas virados que brote fora da membrana plasmática¹⁸. Somente um conjunto limitado de proteínas foi identificado nestes modelos, e suas máquinas devem ser ainda mais elucidada.

Aqui descrevemos um ensaio de alto rendimento que medidas a membrana plasmática recelagem eficiência em células de mamíferos aderentes sujeitos a danos mediadas por recombinação listeriolisina O (LLO)¹⁹. LLO é uma toxina formadoras de poros (PFT) secretada pelo patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes^20,21,22 e pertence a MACPF/CDC (complexo de ataque de membrana, perforina, e Superfamília Citolisina dependente de colesterol). MACPF são mamíferos poro-formando proteínas envolvidas em defesas imunitárias, Considerando que os conjuntos são toxinas bacterianas principalmente produziram por patógenos gram-positivos que danificam as células do hospedeiro para promover sua patogenicidade, estilos de vida²³. Conjuntos são sintetizados como monômeros Water-soluble ou dímeros que se ligam ao colesterol presente na membrana plasmática e oligomerize em um complexo prepore de até 50 subunidades. O complexo de prepore então se reorganiza para inserir β-vertentes através da bicamada lipídica, formando um poro do β-tambor que se estende por 30-50 nm de diâmetro^24,25,26,27.  Estes poros dilatados permitam fluxos de íons e pequenos componentes celulares dentro e fora da célula; no entanto, alguns estudos têm proposto que os poros de tamanhos menores também são formados^28,29,30. Entre os conjuntos, LLO exibe propriedades exclusivas, incluindo agregação irreversível e temperatura-dependente do pH, que é propício para análises de alta produtividade^31,32. LLO pode ser adicionado ao meio de cultura de células no 4 ˚ c, uma temperatura permissiva a sua ligação às células, mas não para a formação do complexo do poro. Iniciação de formação de poros então pode ser sincronizada, elevando a temperatura a 37 ˚ c, permitindo que pela difusão de moléculas de toxina no plano da membrana oligómeros de forma eficiente e para a remodelação conformacional envolvidos na geração de poros. Portanto, seguir o interruptor de temperatura, a cinética de danos celulares dependerá da quantidade de toxina ligada a membrana plasmática. Importante, LLO solúvel (não ligado a membrana plasmática) rápida e irreversivelmente agrega quando a temperatura atinge 37 ˚ c, que alivia a necessidade de lavar as moléculas da toxina não acoplado e limita a extensão dos danos de membrana ao longo do tempo. Por último, porque LLO vincula-se ao colesterol e forma poros nas membranas celulares ricos em colesterol, este ensaio é passível de uma ampla variedade de células de mamíferos. É importante ter em mente que LLO afeta a célula hospedeira sinalização principalmente através de formação de poros, com poucas exceções em qual célula independente de poro sinalização pode ocorrer^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Portanto, não pode ser excluído que LLO sinalização atividades podem influenciar o processo de reparação da membrana.

Este ensaio avalia diretamente a extensão da célula ferindo medindo-se a incorporação de uma célula impermeant fluorocromo (por exemplo, iodeto de propidium) que passivamente entra as células feridas e torna-se altamente fluorescente, uma vez que associa os ácidos nucleicos . Daí, o fluorocromo pode ser mantido em meio de cultura celular durante todo o experimento, permitindo análises em tempo real da célula ferindo. A intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-ligação aumentará a concentração de toxina e, para uma dada concentração de toxina, irá aumentar ao longo do tempo até que todos os poros são formados, e as células são totalmente reparadas ou até saturação é alcançada. O afluxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana poros é um evento de condição sine qua non para selar. Portanto, a eficiência de fechamento pode ser evidenciada indiretamente comparando a célula ferindo em meio de cultura contendo Ca^{2 +} (condição permissiva do reparo) para ferir em um Ca^{2 +}-livre médio (condição restritiva de reparação). Porque a intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-vinculação é diretamente proporcional à concentração de células em cada poço, é importante para as células de semente na mesma concentração em todos os poços. Também é importante enumerar as células em cada poço antes e após o ensaio para garantir que desprendimento celular não ocorre, como flutuante, agregados de células podem obscurecer as leituras de fluorescência que podem complicar a interpretação dos dados. Para enumerar as células, as células expressando nuclear-localizada histona 2B-GFP (H2B-GFP) foram utilizadas neste ensaio. Temperatura controlada, multi-modo, leitores de microplacas combinam rápidas medições, de alto rendimento (usando um formato de placa de 96 ou 384 poços) das intensidades de fluorescência com imagem de microscopia de células vivas, a 37 ° C. Este último pode ser usado para enumerar o número de telemóvel e observar a eventual formação de populações de células distintas.

Em última análise, este ensaio fornece aos usuários a capacidade de expandir seus conhecimentos sobre a complexidade dos mecanismos de reparação da membrana por triagem para moléculas do anfitrião ou reparar de forma exógena adicionados compostos que podem controlar a membrana. O protocolo a seguir descreve as etapas experimentais para medir a eficiência de fechamento de células expostas a LLO e avaliar os efeitos de uma determinada droga ou tratamento celular na eficiência de fechamento.