Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

Les cellules de mammifères sont soumis à un stress mécanique, osmotique et biochimique, entraînant la perte d’intégrité de la membrane plasmique. Sans rescellement de rapide et efficace, les cellules endommagées succomberait rapidement à mort programmée ou nécrotique. Depuis les années 1960, les efforts pour comprendre la membrane plasmique rescellage processus ont été motivées par les conséquences dévastatrices, associés à ses dysfonctionnements. En effet, des maladies telles que la branche-Girdle Muscular Dystrophy, le diabète et le Syndrome de Chediak-Higashi ont été liés à déficient membrane plasmique réparation due à des mutations dans le gène codant dysferline, la production de produits de glycation avancée ainsi que les anomalies dans le régulateur de trafic lysosomal CHS1, respectivement^1,2,3,4,5,6. Toutefois, à ce jour, notre compréhension de la membrane rescellage est encore limitée⁷. Les premières études ont démontré que la membrane rescellage est initiée par l’influx d’extracellulaire Ca^{2 +} par le biais de la plasmalemme endommagés^8,9,10. Depuis lors, plusieurs ne s’excluent Ca^{2 +}-mécanismes dépendants ont été proposées pour refermer les cellules. L’hypothèse de patch propose que, à proximité de la plaie, vésicules intracellulaires fusionnent entre eux et la membrane plasmique endommagée d’agir comme un patch^11,12,13,14. Un second modèle propose cette exocytose calcium-dépendante des lysosomes à la plaie site libère la Sphingomyélinase acide enzyme lysosomale, qui convertit la sphingomyéline en céramide dans le feuillet externe de la membrane plasmique. Ce changement soudain dans la composition lipidique entraîne axée sur le céramide endocytose de la région endommagée^15,16,17. Enfin, le troisième mécanisme proposé implique un rôle pour l’endosomale tri complexes nécessaires au transport (ESCRT) promouvoir la formation de vésicules donnant sur l’extérieur qui bourgeonnent hors de la membrane plasmique¹⁸. Uniquement un ensemble limité de protéines a été identifié dans ces modèles, et leurs machines doit être davantage élucidé.

Nous décrivons ici un test haut débit qui la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères adhérentes soumise à endommager des mesures médiées par recombinaison listériolysine O (LLO)¹⁹. LLO est une toxine en formant des pores (PFT) sécrétée par le pathogène intracellulaire facultatif Listeria monocytogenes^20,21,22 et appartient à la MACPF/CDC (complexe d’attaque membranaire, la perforine, et super-famille cytolysine cholestérol-dépendante). MACPF sont formant des pores mammifères protéines impliquées dans les défenses immunitaires, tandis que les CDC est des toxines bactériennes principalement produites par des agents pathogènes Gram-positifs qui endommagent les cellules de l’hôte pour promouvoir leurs modes de vie pathogènes²³. CDCs sont synthétisées sous forme de monomères solubles dans l’eau ou les dimères qui se lient au cholestérol présent dans la membrane plasmique et oligomerize en un complexe prepore des sous-unités jusqu’à 50. Le complexe prepore réarrange ensuite pour insérer les brins β à travers la bicouche lipidique, formant un pore de β-canon qui s’étend sur 30-50 nm de diamètre^24,25,26,27.  Ces grands pores permettent un flux d’ions et de petites composantes cellulaires dans et hors de la cellule ; Cependant, certaines études ont proposé que les pores de plus petites tailles sont également formé^28,29,30. Entre les CDC, LLO affiche des propriétés uniques, y compris l’agrégation irréversible et température-dépendante du pH, qui est propice à des analyses de haut débit^31,32. LLO peut être ajouté au milieu de culture cellulaire à 4 ° c, une température permissive à sa liaison à des cellules, mais pas à la formation du pore complexe. Ouverture de la formation de pores est synchronisable puis en augmentant la température à 37 ° c, permettant la diffusion efficace des molécules de la toxine dans le plan de la membrane d’oligomères de forme et pour le remodelage conformationnelle impliqués dans la génération de pore. C’est pourquoi, suite à l’interrupteur de température, la cinétique des dommages cellulaires dépendra de la quantité de toxine liée à la membrane plasmique. Ce qui est important, LLO soluble (non lié à la membrane plasmique) rapidement et irréversiblement agrégats lorsque la température atteint 37 ° c, ce qui diminue le besoin d’évacuer les molécules de la toxine non lié et limite l’étendue des dégâts de la membrane au fil du temps. Enfin, parce que LLO se lie au cholestérol et forme des pores dans les membranes riches en cholestérol, ce dosage est favorable à une large gamme de cellules de mammifères. Il est important de garder à l’esprit que LLO affecte la cellule hôte signalisation principalement via la formation de pores, à quelques exceptions près dans quelle cellule indépendante du pore de signalisation peut se produire^{33,34,35,36 ,37,38,},³⁹. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que LLO activités peuvent influer sur le processus de réparation de membrane de signalisation.

Ce test évalue directement l’étendue de la cellule blessant en mesurant l’incorporation d’un fluorochrome imperméants cellulaire (p. ex., l’iodure de propidium) qui pénètre les cellules blessées passivement et qui devient très fluorescent une fois qu’il associe à des acides nucléiques . Par conséquent, le fluorochrome peut être maintenu dans le milieu de culture cellulaire pendant toute l’expérience, ce qui permet des analyses en temps réel des cellules blessant. L’intensité de la fluorescence du colorant acide nucléique-liaison augmente avec la concentration de la toxine et, pour une concentration donnée de toxine, augmentera au fil du temps jusqu’à ce que tous les pores sont formés, et les cellules sont entièrement réparés ou jusqu’à ce que la saturation est atteinte. L’afflux d’extracellulaire Ca^{2 +} à travers les pores de la membrane est un événement de la condition sine qua non pour refermer. Par conséquent, l’efficacité de fermeture peut être indirectement attestée en comparant la cellule blessant dans le milieu de culture contenant du Ca^{2 +} (condition permissive de réparation) à blessant d’un Ca^{2 +}-milieu dépourvu (condition restrictive de réparation). Parce que l’intensité de la fluorescence de la teinture de liaison de l’acide nucléique est directement proportionnelle à la concentration cellulaire dans chaque puits, il est important de cellules des graines à la même concentration dans tous les puits. Il est également important d’énumérer des cellules dans chaque puits avant et après le test pour s’assurer que le détachement de cellules ne se produit pas, comme flottant, cellules agrégées peuvent masquer des lectures de fluorescence qui peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour énumérer des cellules, les cellules exprimant l’histone nucléaire localisé 2 b-GFP (H2B-GFP) ont été utilisées dans ce test. Température contrôlée, multimode, lecteurs de microplaques allient des mesures rapides et à haut débit (à l’aide d’un format de plaque 96 ou 384 puits) d’intensités de fluorescence avec imagerie microscopie des cellules vivantes à 37 ° C. Ce dernier peut être utilisé pour énumérer le nombre de cellules et observer la formation éventuelle de populations cellulaires distincts.

En fin de compte, ce test offre aux utilisateurs la possibilité d’approfondir leur connaissance de la complexité des mécanismes de réparation de membrane de dépistage pour les molécules de l’hôte ou réparer des composés exogène qui peuvent contrôler la membrane. Le protocole suivant décrit les étapes expérimentales afin de mesurer l’efficacité de fermeture des cellules exposées à la LLO et évaluer les effets d’un médicament ou un traitement cellulaire sur l’efficacité de fermeture.