Summary

植物细胞悬浮液中咖啡因的提取、酶活性及咖啡因合成酶基因的表达

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

本协议描述了一种高效的方法, 用于提取和定量的咖啡因在细胞悬浮液中的表达水平和评价咖啡因合酶酶活性的实验过程。编码这种酶的基因。

Abstract

咖啡因 (13, 7-trimethylxanthine) 是一种嘌呤生物碱, 目前流行饮料, 如咖啡和茶。这种次生代谢产物被认为是一种化学防御, 因为它具有抗菌活性, 被认为是一种天然杀虫剂。咖啡因也可以产生负面的化感作用, 防止周围植物的生长。此外, 世界各地的人们使用咖啡因的镇痛和刺激作用。由于对咖啡因技术应用的兴趣, 这种化合物的生物合成途径的研究已经发展。这些研究主要集中于了解调节咖啡因生物合成的生物化学和分子机制。体外组织培养已成为研究这种生物合成途径的有用系统。本文将介绍一步一步的协议, 以量化咖啡因和测量的转录水平的基因 (CCS1) 编码咖啡因合成酶 (CS) 的细胞悬浮液, 以及它的活动。

Introduction

咖啡因是咖啡1属植物 biosynthesized 的次生代谢产物。这生物碱属于甲基黄嘌呤家庭并且被认为作为一个化工厂防御, 因为它可能采取行动反对病原体和草食动物的有害作用2,3。此外, 这种代谢物负责的刺激性能的咖啡饮料, 这是普遍消费全球4,5。由于其特性, 一些研究小组对咖啡因6,7的生物合成途径和分解代谢有兴趣。目前, 植物体外细胞/组织培养作为评价咖啡因积累的替代品, 在不同的生物和非生物学的战略8,9

咖啡因的生物合成涉及 7-甲基黄嘌呤的水解释放从相应的核糖核苷, 其次是有序的n-methylations 在位置3和1。特定s-甘基蛋氨酸 (SAM) 依赖 n-甲基 (NMT) 催化甲基化在位置 7, 而可可碱合酶 (TS) 和 CS 分别参与3和 1-methylations, 生产可可碱和咖啡因。对不同 NMTs 基因编码的研究, 使人们了解调节咖啡因生产的机制10,11。CS 具有n-甲基活性, 催化了咖啡因11生物合成途径的最后两个步骤。在咖啡树幼苗中, 光辐射可以增加 CS 的活性, 从而增加咖啡因的生物合成。最近, 我们发现, 在光照射下维持细胞悬浮液是评价产生非生物胁迫因子影响咖啡因生物合成途径的最佳条件.8。这些研究中获得的信息可能在代谢工程和系统生物学中的应用, 以最大限度地研究这种体外系统中的咖啡因生物合成途径。

鉴于获得合适的咖啡因生物合成模型的优点, 我们优化了咖啡因在细胞悬浮液中的提取条件. 还有可能制定一个有用的协议来研究酶活性, 以及评估咖啡咖啡因合酶 1 (CCS1) 编码这种酶的基因转录水平的方法学步骤。在此, 我们报告了一个协议, 以提取和量化的咖啡因在C.

Protocol

1. 咖啡因在咖啡细胞悬浮液中的提取。 使用C. 咖啡细胞悬浮液9。保持悬浮由双周亚文化在 Murashige 和 Skoog 培养基在 pH 值4.3 与恒定的 100 rpm 震动25°c 在连续的光之下 (8.3 瓦特/m2)。 用11µm 孔滤纸和傅书礼漏斗在真空过滤下收获细胞。 用鳞片将收集到的细胞的新鲜重量进行登记, 用铝箔包裹, 将它们冷冻在液氮中, 并保持在-80 摄氏度直到…

Representative Results

根据图 1所示的方案, 通过对样品进行色谱分析, 对通过本工艺获得的咖啡因提取物进行了薄层定量分析。为了量化细胞提取物中咖啡因的含量, 使用了这种化合物的各种商业标准的曲线 (图 2A)。用 273 nm 的最大吸收峰值 (图 2B) 分析了咖啡因的吸光度模式, 在薄层色谱板上, 咖啡因的峰值分离显示出0.34 和0.39 …

Discussion

我们在这里提出了评价咖啡因含量, CS 活动和转录水平的最佳条件在体外植物组织培养, 如细胞悬浮的C. 阿拉伯咖啡。以前的报告已经证实, 在光照射下维持细胞和在培养基中存在可可碱, 是提高咖啡因含量的合适参数, 从而可以评价咖啡因分离方法。采用反相高效液相色谱法 (RP)。目前, 很少有报道使用一种简单而快速的方法和经济优势来研究细胞悬浮液中的咖啡因生物合成。在这里, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们实验室的工作由委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) 的赠款提供给 SMTHS。这项研究还得到了 CONACyT 和 Sistema 全国 Investigadores (4422) 授予 RJPK (37938 号) 的奖学金的支持。作者感谢 CIATEJ 在撰写本手稿时使用了它的安装。特别感谢 Víctor 博士的所有建议在分子生物学科和 Valentín 门多萨, 国际金融公司, UNAM 的设施在拍摄这篇文章。

Materials

Murashige & Skoog Basal salt mixture PhytoTechnology Laboratories M524 Packge Size: 50 L
Reagent (mg/L)
Ammonium Nitrate (1650)
Boric acid (6.2)
Calcium chloride, anhydrous (322.2)
Cobalt Chloride•H2O (0.025)
Cupric Sulfate•5H2O (0.025)
Na2EDTA•2H2O (37.26)
Ferrous Sulfate•7H2O (27.8)
Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7)
Manganese Sulfate•H2O (16.9)
Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25)
Potassium Iodide (0.83)
Potassium Nitrate (1900)
Potassium Phosphate, Monobasic (170)
Zinc Sulfate•7H2O (8.6)
Supplemented with
myo-inositol (100)
thiamine (10)
cysteine (25)
sucrose (30000)
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3)
6-benzylamine purine (1)
Caffeine SIGMA C0750-5G STANDARD-5g
Theobromine SIGMA T4500 20 g
CAMAG TLC Scanner-4 CAMAG 27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software CAMAG 1.4.10 Software
Isoamyl alcohol (24:1) SIGMA C-0549 500 mL
Cyclohexane JALMEX C4375-13 1 L
Acetone J.T. BAKER 900643 4 L
Methanol J.T. BAKER 9093-03 4 L
Chloroform JALMEX C-4425-15 3.5 L
TLC silica gel 60 F254 Merck 1.05554.0001 TLC plate
β-mercaptoethanol M6250 SIGMA 100 mL
(+)-sodium L- ascorbate A4034 SIGMA 100 g
Trizma base SIGMA T6066 1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38% J.T. Baker 9535-05 2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 232227 Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine Perkin Elmer NET155 Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials SIGMA Z253081
Thermostatic bath/circulator Cole Parmer 60714
Micro centrifugue tube Eppendorf Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials Heathrow Scientific HS23202A 2 mL
Centrifuge 5804 Eppendorf 5804 000925
Vortex Thermolyne LR 5947
Porcelain mortar Fisherbrand FB961B
Filter paper Whatman Z274844 Porosity medium
Picofuge Stratagene 400550 2000 x g
Analytical balance AND HR-120 Model HR-120
Scintillation counter Beckman Coulter 6500
Gel photodocumentation system Bio-Rad Chemic XRS Model Chemic XRS
Compact UV lamp UVP 95002112 UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel SIGMA 2419907 Type 37600 mixer
TRIzol reagent Thermo scientific 15596-018 200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase Thermo scientific #EP0441 10000 U
Oligo (dT)18 primer Thermo scientific #S0131 100 µM
DNase I, RNase-free Thermo scientific #EN0525 1000 U
Magnesium chloride Thermo scientific EN0525 1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid Thermo scientific EN0525 1 mL
dNTP mix Thermo scientific R0191 R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X) Thermo scientific K0251 For 200 reactions of 25 µL
PikoReal Thermo scientific 2.2 Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure USB J75829 100 mL
Isopropyl alcohol Karal 2040 1 L
Ethyl alcohol SIGMA 64175 1 L
Diethyl pyrocarbonate SIGMA D5758 100 mL
Lab Rotator LW Scientific Mod. LW210

References

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Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Hernández-Sotomayor, S. T. Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (140), e58166, doi:10.3791/58166 (2018).

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