카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현
Summary
이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.
Abstract
카페인 (1,3,7-trimethylxanthine)은 커피와 차 등 인기 있는 음료에는 퓨 린 알칼로이드 이다. 항균 성 활동은 자연 살충제로 간주 됩니다 때문에이 2 차 대사 산물 화학 방어로 간주 됩니다. 카페인 또한 주변 식물의 성장을 방지 하는 부정적인 allelopathic 효과 생성할 수 있습니다. 또한, 전 세계의 사람들이 그것의 진통 및 stimulatory 효과 대 한 카페인 소비. 때문에 카페인의 기술 응용 프로그램에 대 한 관심,이 화합물의 생 합성 통로 대 한 연구는 성장 했다. 이러한 연구는 카페인의 생 합성을 조절 하는 생 화 학적 및 분자 메커니즘을 이해에 주로 집중 했다. 조직 문화를 체 외에서 이 생 합성 통로 공부에 대 한 유용한 시스템 되고있다. 이 문서는 C. arabica L. 그것의 활동의 셀 정지에 카페인 synthase (CS) 인코딩 유전자 (CCS1)의 증명서 수준 측정에 대 한 카페인의 정량화에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
카페인은 이다 biosynthesized Coffea1속의 식물 이차 대사 산물. 이 알칼로이드 methylxanthine 가족에 속하는 그리고 그것 병원 체와 herbivores2,3의 부작용에 대 한 역할을 할 수 있기 때문에 화학 공장으로 간주 됩니다. 또한,이 대사 산물은 일반적으로 소모한 전세계4,5커피 음료의 자극 속성에 대 한 책임. 그것의 속성으로 인해 여러 연구 그룹 생 합성 통로 카페인6,7의 놓을 공부에 관심이. 현재, 식물 체 외에서 세포/조직 문화 다양 한 생물과 비 생물 적인 전략8,9에서 카페인 축적을 평가 하기 위한 대체 역할을 합니다.
카페인 생 합성 포함 다음 주문된 N해당 ribose nucleoside에서 7 methylxanthine의 가수분해 릴리스-3-1 위치에서 methylations. 특정 S-adenosyl 메티오닌 (SAM)-종속 N-methyltransferase (NMT) 반면 7, 위치에 메 틸 화를 catalyzes 브로민 synthase (TS) 및 CS 관련에 3-고 1-methylations, 각각, 테오 브로민 제제 생산 및 카페인입니다. 고유한 NMTs를 인코딩 하는 유전자의 연구는 카페인 생산10,11을 조절 하는 메커니즘을 이해 수 있다. N-methyltransferase 활동이 CS 카페인11의 생 합성 통로의 마지막 두 단계를 catalyzes. 커피 나무 묘 목에 그것 보였다 빛 방사선 카페인 생 합성 증가 귀착되는 CS 활동을 증가할 수 있다. 최근에, 우리는 가벼운 방사선 조사에서 C. arabica L.의 셀 정지의 유지 보수는 abiotic 스트레스 요인을 카페인8의 생 합성 통로 영향을 미치는 생산 효과 평가 하기 위한 최적의 조건을 보였다. 이러한 연구에서 얻은 정보 같은 생체 외에서 시스템에 카페인 생 합성 통로의 연구를 극대화 하기 위한 대사 공학 및 시스템 생물학에 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
카페인 생 합성의 연구에 대 한 적합 한 모델의 장점을 감안할 때, 우리 C. arabica L. 셀 정지에 카페인 추출 조건 최적화 그것은 또한 유전자 사본 Coffea 카페인 synthase 1 (CCS1) 인코딩이 효소의 수준을 평가 하기 위한 방법론 단계 뿐만 아니라 효소 활동 공부에 대 한 유용한 프로토콜을 개발할 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 하 고 얇은 층 크로마토그래피와 densitometry (TLC densitometry) C. arabica 셀 정지에 카페인을 계량 프로토콜을 보고 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 현재 여기 카페인 콘텐츠를 평가 하기 위한 최적의 조건, CS 활동 및 수준에서 생체 외에서 식물 조직 배양, C. arabica의 셀 정지 등. 이전 보고서 유지 셀 빛 조사 하 고 문화 매체에 테오 브로민 제제의 존재는 카페인, 카페인 분리 방법을 평가 수의 수준을 높이기 위한 적합 한 매개 변수 확인 반전 단계 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC RP)를 사용 하 여. 현재, 셀 정지 생 합성 카페…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 연구소의 작품 SMTHS 하 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 219893)에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 이 연구 또한 CONACyT와 시스테 나시오날 드 Investigadores (4422) RJPK (No. 37938)을 부여한 장학금에 의해 지원 되었다. 저자는이 원고를 작성 하는 동안 그것의 설치의 사용에 대 한 CIATEJ를 감사합니다. 특별 감사 박사 빅토르 마누엘 곤살레스 멘도사 시설에 대 한 분자 생물학 섹션 및 발렌틴 멘도사 로드리게스, IFC, UNAM에서 모든 권장 사항에 대 한이 문서의 촬영 기간 동안 연장 됩니다.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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