استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات
Summary
ويصف هذا البروتوكول وضع منهجية فعالة لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية للأم آرابيكا جيم- وهي عملية تجريبية لتقييم النشاط الأنزيمي من الكافيين synthase مع مستوى التعبير الجين الذي يشفر هذا الإنزيم.
Abstract
الكافيين (1,3,7-تريميثيلكسانثيني) قلويد البيورين في المشروبات شعبية مثل القهوة والشاي. ويعتبر هذا المستقلب الثانوية دفاع كيميائية لأنها نشاط الميكروبات وتعتبر مبيد حشري طبيعي. يمكن أن تنتج من الكافيين أيضا الآثار السلبية المانعة لمنع نمو النباتات المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، الناس في جميع أنحاء العالم تستهلك الكافيين لإثارة مسكن ومحفزة. سبب الاهتمام بالتطبيقات التكنولوجية من الكافيين، ازداد البحث في مسار السكروز من هذا المركب. هذه الدراسات قد ركزت أساسا على فهم الآليات الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم تخليق الحيوي الكافيين. وقد أصبحت زراعة الأنسجة في المختبر نظام مفيد لدراسة هذا المسار السكروز. هذه المادة سوف تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحديد الكمي للكافيين وقياس مستويات نسخة من الجينات (CCS1) ترميز الكافيين synthase (CS) في تعليق خلية L. C. آرابيكا ، فضلا عن نشاطها.
Introduction
الكافيين هو المستقلب ثانوية التي يتم بيوسينثيسيزيد من نباتات جنس كوفا1. هذا قلويد ينتمي إلى أسرة زانتين، وهو يعتبر هو دفاع عن مصنع الكيميائي نظراً لأنها يمكن أن تعمل ضد الآثار السلبية للعوامل الممرضة واكلات العشب2،3. وبالإضافة إلى ذلك، هذا المستقلب المسؤول عن خصائص محفزة لشرب القهوة، الذي هو عادة المستهلكة في العالم4،5. بسبب خصائصه، مجموعات بحثية عديدة مهتمة بدراسة مسار السكروز وتقويض الكافيين6،7. حاليا، يعمل المصنع في المختبر الثقافات الخلية/الأنسجة كبديل لتقييم الكافيين تراكم تحت مختلف الاستراتيجيات الحيوية وغير الحيوية8،9.
الكافيين الحيوي ينطوي على إطلاق سراح 7-زانتين هيدروليكي من نوكليوزيد الريبوز المقابلة متبوعاً بأمر N-ميثيليشنز في مناصب 3 و 1. -Adenosyl قمحددة ميثيونين (SAM)-تعتمد N-ميثيلترانسفيراسي (NMT) يحفز مثلايشن الموضع 7، بينما الثيوبرومين synthase (TS) و CS تشارك في 3-و 1-ميثيليشنز، على التوالي، إنتاج الثيوبرومين و الكافيين. وقد أتاح دراسة الجينات ترميز نمتس متميزة فهم الآلية التي ينظم الكافيين إنتاج10،11. خدمات العملاء، والذي ن-ميثيلترانسفيراسي النشاط، يحفز الأخيرين خطوات مسار السكروز من الكافيين11. في شتلات أشجار البن، فقد ثبت أن الإشعاعات الخفيفة يمكن زيادة النشاط CS، مما يؤدي إلى زيادة في التركيب الحيوي الكافيين. في الآونة الأخيرة، واظهرنا أن الحفاظ على تعليق خلية من آرابيكا C. L. تحت إشعاع الضوء هو الشرط الأمثل لتقييم الآثار التي تنتج عوامل الإجهاد اللاأحيائية المؤثرة في مسار السكروز من الكافيين8. المعلومات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات قد التطبيقات في علم الأحياء الهندسة ونظم الأيضية لتعظيم دراسة مسار السكروز الكافيين في هذه النظم في المختبر .
بالنظر إلى المزايا للحصول على نموذج مناسب لدراسة التركيب الحيوي الكافيين، نحن الأمثل شروط استخراج الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- ل. كما أنه من الممكن لوضع بروتوكول مفيدة لدراسة النشاط الأنزيمي، فضلا عن الخطوات المنهجية لتقييم مستوى الجينات محاضر كوفا الكافيين synthase 1 (CCS1) الترميز هذا الإنزيم. وهنا، نحن تقرير بروتوكول لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وقياس كثافة (TLC-قياس كثافة).
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن الحاضرين هنا الظروف المثلى لتقييم محتوى الكافيين، CS مستويات النشاط ومحاضر في في المختبر النباتية زراعة الأنسجة، مثل تعليق خلية من آرابيكا جيم. التقارير السابقة قد أكد أن الحفاظ على الخلايا تحت إشعاع الضوء وحضور الثيوبرومين في الأجلين المتوسط وثقافة المعايير المناسبة لزياد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أعمال مختبرنا بتمويل من منحة من ذ Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (مبرزين 219893) إلى سمثس. وأيد هذه البحوث أيضا على زمالة منحته مبرزين والنظام ناسيونال دي إينفيستيجادوريس (4422) إلى رجبك (رقم 37938). يشكر المؤلفون سيتي لاستخدام منشآتها أثناء كتابة هذه المخطوطة. يتم توسيع شكر خاص إلى الدكتور فيكتور مانويل غونزاليس مندوزا لجميع التوصيات في قسم البيولوجيا الجزيئية وفالنتين مندوزا رودريغيز، والمؤسسة المالية الدولية، وجامعة المكسيك الوطنية المستقلة للمرافق أثناء تصوير هذه المادة.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O’Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
