Summary

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Published: September 25, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Abstract

Gouttelette numérique polymérisation en chaîne (ddPCR) est une méthode de réaction en chaîne (PCR) ultrasensible polymérase quantitative basée sur le fractionnement des échantillons dans des milliers de taille nanométrique de réactions individuelles eau-dans-huile. Récemment, ddPCR est devenu un des outils plus précis et plus sensibles pour la détection de l’ADN (ADNct) tumeur en circulation. Une des principales limites de la technique standard ddPCR est le nombre limité de mutations qui peut être projeté par réaction, comme les sondes d’hydrolyse spécifiques reconnaissant chaque version allélique possible sont nécessaires. Une autre méthode, le drop-off ddPCR, augmente le débit, car il ne nécessite qu’une seule paire de sondes pour détecter et quantifier potentiellement toutes les altérations génétiques dans la région ciblée. Drop-off ddPCR affiche une sensibilité comparable aux déterminations ddPCR classiques avec l’avantage de détecter un plus grand nombre de mutations dans une seule réaction. Il est rentable, conserve de précieux échantillons et peut aussi servir comme un outil de découverte lorsque les mutations ne sont pas connues a priori.

Introduction

Des milliers de mutations somatiques liées au développement du cancer ont été signalés1. Parmi ceux-ci, quelques-uns sont des marqueurs prédictifs de l’efficacité de la thérapie ciblée 2,3 et dépistage de ces mutations génétique est pratique clinique de routine maintenant. Gouttelette numérique technologie PCR (ddPCR) peut être utilisée pour surveiller la présence ou l’absence de mutations avec une précision de détection élevé et est hautement compatible avec biopsies liquide non invasif4,5. Cependant, les tests de ddPCR actuellement sont principalement conçus pour détecter les mutations connues a priori. Ceci limite fortement l’utilisation de ddPCR comme un outil de découverte lorsque la mutation est inconnue. En effet, lors de la conception conventionnelle de ddPCR, une sonde d’hydrolyse reconnaissant l’allèle sauvage (WT sonde) est en concurrence avec une sonde spécifique reconnaissant l’allèle mutant (MUT sonde) (Figure 1 a). La sonde avec une affinité plus élevée s’hybride au modèle et libère ses fluorophore, indiquant la nature de l’allèle correspondant. Les données de fluorescence obtenues pour chaque gouttelette peuvent être visualisées dans un nuage de points représentant la fluorescence émise par les sondes em et MUT de différentes dimensions. Une représentation schématique d’un résultat typique pour un dosage ddPCR conventionnelle est présentée dans la Figure 1 a. Dans cet exemple, la nuée bleue correspond à des gouttelettes contenant des allèles WT identifiées par la sonde WT, alors que le nuage rouge correspond à gouttelettes où l’allèle MUT a été amplifié et identifiée par la sonde MUT. Selon la quantité d’ADN chargé dans la réaction, des gouttelettes positives doubles contenant des amplicons fois WT et MUT peuvent apparaître (Nuage vert). Le nuage gris clair correspond à gouttelettes vides.

Étant donné que la plupart des plates-formes permettant la détection d’un nombre limité de fluorophores (généralement 2, mais jusqu’à 5), un débit de ddPCR conventionnelle est limité. Cibler des régions présentant des mutations adjacentes multiples exige donc, design de techniquement difficiles ddPCR multiplex essais ou l’utilisation de multiples réactions ciblant chaque mutation en parallèle. La stratégie de ddPCR Drop-off, permet de surmonter cette limitation car il peut éventuellement détecter toute modification génétique dans une région cible à l’aide d’une paire de sondes d’hydrolyse WT. Le premier sonde (Probe 1) couvrant qu’une séquence non variable, adjacente à la région cible et la deuxième sonde (sonde 2) est complémentaire de la séquence WT de la région cible où les mutations sont attendus (Figure 1 b). Alors que la première sonde quantifie le montant total des molécules amplifiables dans la réaction, la deuxième sonde discriminatoire WT et MUT allèles par hybridation sous-optimal de séquences de mutants. Sonde 2 peut identifier plusieurs types de mutations dans la région (substitutions nucléotidiques simples ou multiples, suppression, etc.) la cible6. Comme dans les ddPCR classique, le nuage gris clair correspond à gouttelettes ne contenant aucune des molécules d’ADN. Il est important de rappeler que dans ce type de test, une séparation optimale des nuages WT et MUT est tributaire de la quantité d’ADN chargé dans la réaction, puisque les gouttelettes contenant les WT et MUT allèles cible ne peut pas être distinguées de gouttelettes contenant uniquement le WT formulaire. Par conséquent, ce test nécessite que la plupart des gouttelettes contiennent pas plus d’une copie du gène ciblé.

Protocol

Le protocole présenté ici suit les directives d’éthique de l’Institut Curie. Tous les échantillons humains provenaient de patients inscrits, après consentement éclairé, dans études approuvées par le Conseil d’examen institutionnel à l’Institut Curie. 1. collecte, stockage de Plasma et l’Extraction d’ADN acellulaire de sang NOTE : ADN extrait de n’importe quel type de « tissu » peut être utilisé (p. ex., frais ou formaldéhyde-co…

Representative Results

Dans une étude de validation, des mutations exon 2 KRAS (codons 12 et 13) et EGFR exon 19 suppressions ont été étudiées en tissus FFPE et échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de cancer en utilisant le dépôt ddPCR stratégie6. La sonde de déclin KRAS interrogé une région bp 16 englobant plusieurs mutations dans l’exon 2 du gène KRAS , qu…

Discussion

Pour concevoir un test de ddPCR déclin efficace, l’optimisation est cruciale, et le protocole doit être suivi attentivement. Chaque combinaison des amorces et des sondes a une efficacité de réaction PCR unique. Ainsi, une analyse individuelle doit être soigneusement validés sur des échantillons de contrôle avant d’être utilisé sur des échantillons d’essai précieux. Optimisation et validation sont importantes pour certifier la détection de signal de crête et évaluer la spécificité et la sensibilité…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Institut Curie SiRIC (subvention INCa-DGCD-4654). Les auteurs souhaitent remercier Caroline Hego pour sa contribution à la vidéo.

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender) BD 367863 EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) Qiagen 55114 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) Qiagen 937556 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system Qiagen 9001297 fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus Qiagen 19413 For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226 The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader Bio-Rad 186-3003 or186-4003, respectively The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator Bio-Rad 186-3002 or 186-4002, respectively Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851196 Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer Bio-Rad 181-4000 PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder Bio-Rad 186-3051 Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets Bio-Rad 186-4007 Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix Bio-Rad 186-3010 ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates Eppendorf 951020362 96-well semi-skirted plates
Foil seal Bio-Rad 181-4040 Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL Eppendorf 0030 108.051 Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set HORIZON HD780 The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 Life Technologies Q32854 The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer

References

  1. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
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Cite This Article
Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F., Pierga, J., Stern, M., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).

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