하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된¹되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 ^2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies^4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방울에 대 한 얻은 형광 데이터 WT 및 MUT 프로브 다른 차원에 의해 방출 하는 형광을 나타내는 산 점도에 구상 될 수 있다. 기존의 ddPCR 분석 결과 대 한 일반적인 결과의 도식 표현 그림 1A에 제공 됩니다. 이 예제에서는 블루 클라우드 빨간 구름 방울 있는 MUT 대립 유전자 증폭 되었고 MUT 프로브에 의해 식별에 해당 하는 반면 WT 프로브로 식별 하는 WT 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 반응에서 로드 하는 DNA의 양에 따라서 WT와 MUT amplicons 포함 된 더블 긍정적인 방울 (녹색 구름) 나타날 수 있습니다. 빛 회색 구름 빈 물방울에 해당합니다.

대부분의 플랫폼 fluorophores (보통 2, 최대 5만)의 제한 된 수의 검출에 대 한 허용, 기존의 ddPCR의 처리량 제한 됩니다. 따라서, 여러 개의 인접 한 돌연변이와 영역을 대상으로 기술적으로 도전적인 멀티플렉스 ddPCR 분석 실험 또는 동시에 각 돌연변이 대상으로 하는 여러 반응의 사용의 디자인을 필요 합니다. 그것은 잠재적으로 독특한 WT 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 대상 지역 내에서 어떤 유전 변경 감지 수 있습니다 드롭 ddPCR 전략이이 제한 극복. 첫 번째 프로브 (Probe 1) 커버 비 변수 시퀀스, 대상 지역 및 두 번째 프로브 (Probe 2)은 돌연변이 대상 영역의 WT 시퀀스에 보완 예정 (그림 1B). 첫번째 조사 반응에 amplifiable 분자의 총 금액을 단정, 하는 동안 두 번째 프로브 WT 및 MUT 대립 유전자 돌연변이 시퀀스에 최적의 교 잡에 의해 차별. 프로브 2 대상 지역 (단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)⁶에 돌연변이의 여러 종류를 식별할 수 있습니다. 기존의 ddPCR에서 빛 회색 구름 없는 DNA 분자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 이 유형의 분석 결과에 WT MUT 구름의 최적의 분리는 DNA WT와 MUT 대상 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울만 WT를 포함 하는 작은 물방울에서 구분할 수 없습니다 이후 반응, 로드의 수량에 따라 기억 하는 것이 중요 하다 양식입니다. 따라서,이 분석 결과 대부분 물방울 타겟된 유전자의 둘 이상의 복사본을 포함 해야 합니다.