Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için
Summary
Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) örnek ayırma yağı su bireysel tepkiler nano ölçekli binlerce içine temel bir son derece hassas nicel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemidir. Son zamanlarda, ddPCR tümör DNA (ctDNA) algılama dolaşan için en doğru ve hassas araçlarından biri haline gelmiştir. Her olası allelic sürüm tanıma belirli hidroliz probları gerektiğinden bir standart ddPCR tekniği önemli sınırlamaları tepki ekranlı mutasyonlar kısıtlı sayısıdır. Probları algılamak ve potansiyel olarak tüm genetik değişiklikler hedeflenen bölgede ölçmek için yalnızca tek bir çift gerektirdiğinden alternatif bir metodoloji, teslim ddPCR, üretilen iş, artırır. Teslimat ddPCR geleneksel ddPCR deneyleri mutasyonlar daha fazla sayıda tek bir reaksiyonu tespit avantajı ile karşılaştırılabilir duyarlılık görüntüler. Düşük maliyetli, değerli örnek malzeme tasarrufu ve mutasyonlar bir prioribilinen değil aynı zamanda bir keşif aracı olarak kullanılabilir.
Introduction
Somatik mutasyon kanser geliştirilmesi için ilgili binlerce bildirilen1olmuştur. Bunlar arasında birkaç akıllı işaretleri etkinliğinin hedefe yönelik tedavi 2,3 ve şimdi rutin klinik pratikte bu mutasyonlar eleme genetik. Damlacık dijital PCR (ddPCR) teknoloji olup mutasyonların yüksek algılama hassasiyeti ile izlemek için kullanılan ve non-invaziv sıvı biyopsi4,5ile son derece uyumludur. Ancak, geçerli ddPCR deneyleri öncelikle bir prioribilinen mutasyonlar algılamak için tasarlanmıştır. Mutasyon bilinmeyen olduğunda bu ciddi bir şekilde ddPCR bir keşif aracı olarak kısıtlar. Nitekim, geleneksel ddPCR tasarımında, vahşi tipi gen (WT sonda) tanıma bir hidroliz sonda mutant gen (MUT sonda) (Şekil 1A) tanıma belirli bir sonda ile buz dansında yarışmaktadır. Sonda daha yüksek benzeşimli şablona hybridizes ve karşılık gelen alleli niteliği gösteren onun fluorophore serbest bırakır. Her damla için elde edilen floresan veriler farklı boyutta WT ve MUT probları tarafından yayılan floresans temsil eden bir dağılım çizim olarak görüntülenmeyecektir. Geleneksel ddPCR tahlil için tipik bir sonuç şematik gösterimi Şekil 1Aile sunulur. Örneğin, mavi bulut ise kırmızı bulut içinde MUT alleli edilmiş amplifikatör ve MUT sondası tarafından tanımlanan damlacıkları karşılık gelen WT sondası tarafından tanımlanan WT gen içeren damlacıklar karşılık gelir. Tepki olarak yüklenen DNA miktarı bağlı olarak, Çift Kişilik olumlu damlacıkları WT ve MUT amplicons içeren (yeşil bulut) görünebilir. Işık gri bulut için boş damlacıkları karşılık gelir.
Fluorophores (genellikle 2, 5’e kadar ama) sınırlı sayıda tespiti için en platformlar izin beri geleneksel ddPCR-den geçerek sınırlıdır. Bu nedenle, birden çok bitişik mutasyonlar bölgeleriyle hedefleme Teknik olarak çok katmanlı ddPCR deneyleri veya birden çok tepkiler her mutasyon paralel hedefleme kullanımı zor tasarım gerektirir. Teslimat ddPCR strateji gibi potansiyel olarak WT hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak bir hedef bölge içinde herhangi bir genetik değişiklik tespit edebilen bu sınırlamanın üstesinden gelir. Hedef bölge ve ikinci sonda (sonda 2) bitişik olmayan değişken sıra mutasyonlar nerede hedef bölge WT dizisi tamamlayıcı ilk sonda (sonda 1) kapsar (Şekil 1B) bekleniyor. İlk sonda tepki amplifiable molekülleri toplam miktarı quantifies iken, ikinci sonda WT ve MUT allelleri mutant sıralarını alt-optimal hibridizasyon tarafından ayrımcılık. Sonda 2 hedef bölge (tek veya birden fazla nükleotit oyuncu değişikliği, silme vb.)6‘ mutasyonların birden çok türü tanımlayabilirsiniz. Geleneksel ddPCR olduğu gibi hafif gri bulut yok DNA molekülleri içeren damlacıklar karşılık gelir. Bu tür tahlil, en uygun WT ve MUT bulutlar ayrılması WT ve MUT hedef gen içeren damlacıklar sadece WT içeren damlacıklar ayırt edemez beri tepki olarak yüklenen DNA miktarına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir formu. Bu nedenle, bu tahlil çoğu damlacıkları hedeflenen gen birden fazla kopyasını içermesini gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir verimli teslimat ddPCR tahlil tasarlamak için optimizasyon çok önemli ve protokol dikkatle izlenmesi gerekir. Astar ve sondalar her birleşimi bir benzersiz PCR reaksiyon verimlilik vardır. Böylece, bir tek tek tahlil dikkatli bir şekilde kontrol örnekleri üzerinde değerli test örnekleri üzerinde kullanılmadan önce doğrulanması gerekiyor. En iyi duruma getirme ve doğrulama en yüksek sinyal algılama tasdik ve özgüllük ve duyarlılık değerlendirmek önemlidir. İletişim kuralında açıklandığ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Institut Curie SiRIC (grant Inca-DGOS-4654) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Caroline Hego video onun katkılardan ötürü teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
