Summary

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Published: May 24, 2018
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Summary

Aqui, apresentamos os protocolos para visualizar respostas de cálcio (Ca2 +) eliciadas células HeLa infectadas por Shigella. Otimizando os parâmetros de infecção bacteriana e imagem latente com sondas fluorescentes de Ca2 + , caracterizam-se atípica globais e locais Ca2 + sinais induzidos por bactérias sobre uma escala grande da cinética da infecção.

Abstract

CA2 + é um íon ubíquo envolvido em todos os processos celulares conhecidos. Enquantoglobais Ca 2 + respostas podem mudar o destino de célula, variações locais grátis Ca2 + citosólico concentrações, ligada à liberação de lojas internas ou um influxo através dos canais da membrana plasmática, regulam processos de célula cortical. Patógenos que aderir ou invadir o hospedeiro células gatilho uma reorganização do citoesqueleto de actina subjacentes a membrana plasmática de anfitrião, que provavelmente afeta Ca2 + sinalização globais e locais. Porque esses eventos podem ocorrer em baixas frequências de forma pseudo estocástica sobre cinética estendida, a análise de Ca2 + sinais induzidos por patógenos gera grandes desafios técnicos que devem ser abordadas.

Aqui, nós relatamos protocolos para a detecção de Ca2 + sinais globais e locais em cima de uma infecção de Shigella de células epiteliais. Estes protocolos, artefatos ligados a uma exposição prolongada e Fotodano associado com a excitação de sondas fluorescentes de Ca2 + são solucionados problemas ao controlar rigorosamente os parâmetros de aquisição durante períodos de tempo definidos durante um Shigella invasão. Os procedimentos são implementados para analisar com rigor a amplitude e frequência da global citosólico Ca2 + sinais durante a cinética de infecção prolongada usando a sonda química Fluo-4.

Introduction

CA2 + regula todos os processos de célula conhecida, incluindo a reorganização do citoesqueleto, respostas inflamatórias e caminhos de morte celular relacionados ao hospedeiro-patógeno interações1,2,3. Sob condições fisiológicas, basal citosólico Ca2 + as concentrações são baixas, em centenas de gama nM, mas podem ser submetidas a aumentos transitórios mediante estimulação agonista. Estas variações frequentemente apresentam comportamento oscilatório através da ação das bombas e canais em membranas do plasma e retículo endoplasmático. O padrão dessas oscilações é caracterizado pelo período, duração e amplitude de Ca2 + aumenta e é descriptografado por células que, por sua vez, provocam respostas específicas no que é conhecido como o Ca2 + código4,5 . Um aumento sustentado da citosólico Ca2 + concentração sob condições patológicas pode levar à morte celular associada a permeabilização de membranas mitocondriais e o lançamento do pro-apoptotic ou fatores necróticos6, 7.

Shigella, o agente causador da disenteria bacilar, invade células epiteliais injetando efetores em células hospedeiras, usando um tipo III secreção sistema (T3SS)8,9. Uma invasão de Shigella das células do hospedeiro é associada com o locais e globais Ca2 + sinais eliciados a T3SS. Quanto à formação de poros toxinas, o translocon T3SS que insere as membranas de pilha de anfitrião e é necessária para a injeção de efetores T3SS é provavelmente responsável para a ativação do PLC e do triphosphate do inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependente Ca2 + lançamento. A combinação de estimulação localizada PLC e o acúmulo de actina polimerizada em sites de um resultado de invasão de Shigella em uma Ca InsP3 dependente atipicamente longa duração2 + versão10. O efetor do III tipo IpgD, um bisfosfato fosfatidil 4,5 (PIP2) -4-fosfatase, limita a quantidade de local de PIP2, assim, controlar a quantidade de substrato disponível para PLC gerar InsP3, que contribui para o confinamento do local Ca2 + respostas em sites de invasão bacteriana11,12. Estes locais Ca 2 + respostas provavelmente contribuem para a polimerização de actina no Shigella invasão sites10. Global Ca2 + respostas que são também provocadas pela Shigella, no entanto, são dispensáveis para o processo de invasão bacteriana, mas provocar a abertura de hemichannels connexin na membrana plasmática e a liberação de ATP no extracelular compartimento. Lançado ATP agindo de forma parácrina, por sua vez, estimula aCa 2 + oscilatórias respostas nas células ao lado da célula infectada. IpgD também é responsável pela formaçãoglobais Ca 2 + respostas em erráticas respostas isoladas com dinâmica lenta. Eventualmente, após uma prolongada infecção bacteriana, IpgD leva para a inibição de InsP3 mediada por Ca2 + sinais. Através de sua interferência com sinalização de Ca2 + , IpgD atrasa um Ca2 +-ativação Calpaína dependente, levando para a desmontagem de estruturas de adesão focal e o descolamento prematuro da infectado as células13.

Enquanto Ca2 + sinais estão envolvidos em aspectos críticos da patogênese, a utilização de um microrganismo gera um número de desafios técnicos que não são encontrados em estudos clássicos agonista. Os protocolos descritos aqui usam o comumente usado fluorescente Ca2 + indicador químico impresso Fluo-4 que nós produzimos para caracterizar o local de Ca2 + sinais durante uma infecção de Shigella . Passos essenciais para a detecção destes sinais são discutidos, bem como procedimentos implementados para sua análise quantitativa que é necessário para caracterizar o papel de efetores bacterianas em sinalização de Ca2 + .

Protocol

1. preparações Preparação de bactérias As bactérias da placa — estirpe do selvagem-tipoShigella expressando a adesina umFAE (M90T-umFAE) — para um trypticase agar soja (TCS) placa contendo 0,01% de vermelho de Congo (CR) e incube-os por 18 h a 37 ° C.Nota: Para aumentar a sua reprodutibilidade, as placas de Shigella obtidas na etapa 1.1.1 são armazenadas a 4 ° C e devem ser usadas dentro de uma semana, porque todas as colônias em meio de CR eventua…

Representative Results

Invasão de Shigella está associado atípica duradouro Ca2 + respostas locais: Seguindo o protocolo mencionado acima, as células HeLa Fluo-4-carregado foram desafiadas com WT Shigella e aquisições de fluxo foram realizadas para analisar sinais de Ca2 + . Um experimento de representante é mostrado na Figura 1, com uma série de imagens de lapso de tempo da in…

Discussion

Este manuscrito descreve o protocolo que estamos projetados para seguir Ca2 + sinais locais durante a cinética relativamente curta de uma invasão de Shigella , bem como Ca2 + respostas globais durante a cinética estendida de Shigella. Abaixo, a chave encontram problemas que precisam ser abordadas para otimizar a detecção de Ca2 + sinais minimizando qualquer interferência com os processos biológicos.

Química vs geneticamente codif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jenny Lee Thomassin Agradecemos a ajuda em editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado pela ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede do Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Cristina Sun é um destinatário de uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu são destinatários de uma troca de WBI-França Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l’Enseignement supérieur et des de cadre de la Recherche dans le parcerias Hubert Curien).

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

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Cite This Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

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