Summary

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להמחיש תגובות סידן (Ca2 +) שהפיק הלה תאים נגועים על ידי שיגלה. על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של זיהום חיידקי, הדמיה עם Ca2 + רגשים פלורסנט, מאופיינים טיפוסיות גלובאליים ומקומיים Ca2 + אותות הנגרמת על ידי חיידקים על פני מגוון רחב של קינטיקה זיהום.

Abstract

Ca2 + הוא יון נמצא בכל מקום המעורבים בתהליכים כל הסלולר מוכרות. בעוד Ca העולמית2 + תגובות עשוי להשפיע על גורל, וריאציות מקומיות בריכוזים חינם Ca2 + cytosolic, מקושר לשחרר מן החנויות פנימי או זרם דרך קרום פלזמה ערוצים, לווסת תהליכים סלולרי קורטיקלית. פתוגנים לדבוק או לפלוש מארח תאי מפעיל ארגון מחדש של שלד התא אקטין שבבסיס קרום פלזמה המארח, אשר סביר משפיע הן גלובליות ומקומיות Ca2 + מערכת אזעקה. כי אירועים אלה עשויים להתרחש בתדרים נמוכים באופן מדומים סטוכסטי מעל קינטיקה מורחבת, הניתוח של Ca2 + אותות המושרה על ידי פתוגנים מעלה האתגרים הטכניים העיקריים שצריך להתייחס.

כאן, אנו מדווחים פרוטוקולים עבור הגילוי של Ca גלובאליים ומקומיים2 + אותות על זיהום שיגלה של תאים אפיתל. פרוטוקולים אלה, חפצי אמנות מקושר חשיפה ממושכת, נזקי המשויך את עירור של Ca2 + רגשים פלורסנט הן troubleshot על ידי והטכני שליטה הפרמטרים רכישה דרך פרקי זמן מוגדרים בזמן שיגלה הפלישה. נהלים מיושמים בקפדנות ולנתח את משרעת ואת התדירות של Ca העולמית cytosolic2 + אותות במהלך זיהום המורחבת קינטיקה באמצעות המכשיר כימי Fluo-4.

Introduction

Ca2 + מסדיר את כל התהליכים תא ידועים, כולל cytoskeletal רה-ארגון, תגובות דלקתיות של מוות התא מסלולים הקשורים פתוגן-פונדקאי אינטראקציות1,2,3. בתנאים פיזיולוגיים, הבסיס cytosolic Ca2 + ריכוזים נמוכים, של מאות ננומטר טווח, אבל יכולה להיות נתונה מגביר ארעי על גירוי אגוניסט. לווריאציות אלה לעתים קרובות להציג התנהגות מתנדנדות דרך הפעולה של משאבות וערוצי בקרום פלאזמה ורשתית תוך-פלזמית. הדפוס של תנודות אלה מתאפיינת התקופה, משך, ו משרעת של Ca2 + גדל ולאחר מפוענחים על ידי תאים אשר, בתורו, לעורר תגובות ספציפיות בתוך מה שנקרא Ca2 + קוד4,5 . עלייה מתמשכת ב Ca2 + הריכוז cytosolic בתנאים פתולוגי עלול להוביל מוות של תאים הקשורים את permeabilization של ממברנות מיטוכונדריאלי שחרורו של פרו-אפופטוטיים להיפגע או גורמי נמק6, 7.

שיגלה, סוכן סיבתי של דיזנטריה bacillary, פולש לתאי האפיתל על ידי הזרקת effectors לתוך התאים המארחים באמצעות סוג III הפרשת מערכת (T3SS)8,9. פלישה שיגלה התאים מארח מזוהה עם גלובליים ומקומיים Ca2 + אותות שהפיק את T3SS. באשר להיוות נקבובית רעלים, את translocon T3SS מוסיף לתוך קרום התא המארח, נדרש עבור ההזרקה של T3SS effectors הוא סביר אחראי על ההפעלה של בקר לוגי מיתכנת, של אינוזיטול (1, 4, 5) טריפוספט (InsP3)-Ca התלויים2 + שחרור. השילוב של הגירוי PLC מקומי ואת ההצטברות של אקטין polymerized באתרים של תוצאה הפלישה שיגלה ב אופיינית ארוכות Ca תלויי-InsP32 + שחרור10. אפקטור השלישי סוג IpgD, bisphosphate phosphatidyl 4.5 (PIP2) -4-פוספטאז, מגביל את מקומי כמות PIP2, ובכך שולט כמות המצע זמינים עבור בקר לוגי מיתכנת ליצירת InsP3, אשר תורמת ההחזקה של Ca מקומי2 + תגובות על פלישת חיידקים אתרי11,12. מקומיים Ca2 + תגובות אלה עשוי לתרום פלמור אקטין שיגלה הפלישה אתרים10. גלובל Ca2 + התגובות הן גם שהפיק שיגלה, עם זאת, לוותר על התהליך פלישת חיידקים אבל לעורר את הפתיחה של hemichannels connexin ב קרום פלזמה ואת שחרורו של ATP ב- חוץ-תאית תא. ATP שפורסמו מתנהג בצורה paracrine, בתורו, מעוררת Ca תגובות2 + מתנדנדות בתאים לצד התא הנגוע. IpgD הוא גם אחראי על עיצוב Ca העולמית2 + תגובות לתוך התגובות מבודדים לא יציב עם דינמיקה איטי. בסופו של דבר, על זיהום חיידקי ממושכת, IpgD מוביל עיכוב של בתיווך InsP3 Ca2 + אותות. דרך הפרעות שלו עם איתות2 + Ca, IpgD מעכב Ca2 +-הפעלת calpain תלויים שמוביל את פירוק מבנים אדהזיה מוקד ולהתנתקות מוקדמת של נגוע תאים13.

בעוד Ca2 + אותות מעורבים היבטים קריטיות של הפתוגנזה, השימוש מיקרואורגניזם מעלה מספר אתגרים טכניים, כי לא נתקלתי במחקרים אגוניסט קלאסית. הפרוטוקולים המתוארים כאן להשתמש בשימוש נפוץ פלורסנט Ca2 + כימיים מחוון Fluo-4 אנחנו המהנדס לאפיין Ca מקומי2 + אותות במהלך זיהום שיגלה . שלבים קריטיים עבור זיהוי אותות אלה נידונות, כמו גם הליכי מיושם עבור שלהם ניתוח כמותי הנדרשות על מנת לאפיין את התפקיד של חיידקי effectors ב Ca2 + איתות.

Protocol

1. תכשירים הכנה חיידקים צלחת החיידקים – זן פראי-סוגשיגלה לבטא את adhesin AfaE (M90T-AfaE) — trypticase סויה (TCS) אגר צלחת 0.01% המכיל קונגו אדום (CR) ועל תקופת דגירה אותם של 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.הערה: כדי להגדיל הפארמצבטית שלהם, הצלחות שיגלה שהושג בשלב 1.1.1 מאוחסנים ב 4 ° C, אמור לשמש …

Representative Results

הפלישה שיגלה משויך טיפוסיות לאורך זמן מקומי Ca2 + תגובות: בעקבות פרוטוקול שהוזכרו לעיל, הלה טעון-Fluo-4 תאים לערער עם WT שיגלה , זרם הרכישות בוצעו כדי לנתח אותות2 + Ca. ניסוי נציג מוצג באיור 1, עם סדרת תמונות בציל…

Discussion

כתב יד זה מתאר פרוטוקול אנחנו המהנדס לעקוב Ca מקומי2 + אותות במהלך קינטיקה קצר יחסית של פלישה שיגלה , כמו גם Ca העולמית2 + תגובות במהלך קינטיקה מורחבת של שיגלה. להלן, מפתח הנושאים ניתן למצוא את זה צריכים להיות מופנית כדי למטב את הגילוי של Ca2 + אותות תוך מזעור כל התערבות…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Thomassin ג’ני-לי עזרה בעריכת כתב היד. העבודה נתמכה על ידי ANR מעניקה MITOPATHO ו- PATHIMMUN, מעניקה מן Labex Memolife PSL IDEX Shigaforce. Chunhui השמש הוא הנמען של מענק Ph.d. מהמועצה מלגה סין. לורן Combettes Nhieu ואן טראן הבחור הם מקבלי שירות המרת WBI-צרפת Tournesol תוכנית N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles הבינלאומי, Fonds דה לה של רשרש, Ministère פרנקאיס דה המלון étrangères et européennes, Ministère de l’Enseignement ומוסרת et des קאדר dans le Recherche de la Partenariats הובר Curien).

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

References

  1. Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
  4. Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
  5. Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
  6. Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
  7. Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
  8. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
  9. Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
  10. Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
  11. Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
  12. Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
  13. Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
  14. Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
  15. Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
  16. Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).

Play Video

Cite This Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

View Video