Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Las mitocondrias son sitios críticos de almacenamiento de Ca^{2 +} intracelular y la señalización. Décadas de investigación han demostrado que las mitocondrias tienen la capacidad de importar y el secuestro de Ca^{2 + 1,2}. Las mitocondrias, sin embargo, no son meramente pasivos sitios de almacenamiento de Ca^{2 +} . CA^{2 +} en el compartimiento mitocondrial realiza funciones de señalización fundamentales incluyendo la regulación de la producción metabólica y la activación de las vías de muerte celular mitocondrial mediado, que ha sido previamente revisado³. Para la regulación metabólica, Ca^{2 +} aumenta la actividad de Deshidrogenasas matriz localizada tres del ciclo del ácido tricarboxílico, así como complejos de la cadena respiratoria, para aumentar la producción de energía mitocondrial^4,5 . Con sobrecarga de Ca^{2 +} mitocondrial y altera mitocondrial Ca^{2 +} manejo, Ca^{2 +} activa transición de permeabilidad mitocondrial poro abierto (MPTP), llevando a permeabilización de la membrana interna mitocondrial, pérdida potencial de la membrana, la disfunción mitocondrial, inflamación, ruptura y en última instancia, la célula muerte^6,7,8,9. Por lo tanto, Ca^{2 +} señalización mitocondrial impacta directamente la vida celular y vías de la muerte a través de control metabólico y eje de MPTP a la muerte.

En los últimos años, allí ha sido expandiendo rápidamente interés en el estudio de Ca^{2 +} dinámica mitocondrial debido en gran parte a la identificación de los componentes moleculares de la Ca^{2 +} uniporter mitocondrial complejo, un interior mitocondrial importación de transportador de membrana que es un modo primario de Ca^{2 +} en la matriz mitocondrial ^10,11,12. Identificación de estas subunidades estructurales y reguladoras de la uniporter ha traído la posibilidad de apuntar genético mitocondrial Ca^{2 +} afluencia para modulan la función mitocondrial y la disfunción y facilitó el estudio de la contribución de la uniporter complejo mitocondrial Ca^{2 +} afluencia a enfermedad^13,14,15. De hecho, Ca^{2 +} señalización mitocondrial se ha implicado en las patologías de una gran variedad de enfermedades que van desde la enfermedad cardiaca y neurodegeneración, cáncer^{16,17,18, 19,20}.

Dada la importancia fundamental de mitocondrial Ca^{2 +} en el metabolismo y muerte celular y combinado con el amplio alcance de los sistemas biológicos Ca^{2 +} señalización mitocondrial impactos, métodos para evaluar la Ca mitocondrial^{2 +} afluencia son de gran interés. No en vano, se han desarrollado una variedad de técnicas y herramientas para medir mitocondrial Ca^{2 +} . Estos incluyen métodos que utilizan herramientas tales como fluorescente Ca^{2 +}-tintes sensibles^21,22 y genéticamente codificado Ca^{2 +} sensores orientados a la mitocondria, como el cameleon y aequorin^{23, 24}. El objetivo de este artículo es destacar diferentes métodos y sistemas de modelo en el que se puede medir la absorción de Ca^{2 +} mitocondrial. Presentamos dos métodos experimentales para evaluar mitocondrial Ca^{2 +} afluencia capacidad. Utilizando mitocondrias cardiacas como ejemplo, detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorción utilizando el Ca^{2 +} sensible tinte verde-5N de calcio que es ideal para las mitocondrias aisladas de tejidos¹⁴ . Uso de las células 3T3 NIH cultivadas, también Describimos un análisis de basado en la proyección de imagen de microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca^{2 +} en células permeabilized con el Ca^{2 +} sensible tinte Rhod-2/AM²⁵.