अलग Mitochondria और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में Mitochondrial कैल्शियम आमद का विश्लेषण
Summary
यहां, हम अलग mitochondria और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में mitochondrial Ca2 + आमद के माप के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पृथक mitochondria के लिए, हम विस्तार से एक प्लेट रीडर-ca के आधार2 + आयात परख ca2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N का उपयोग कर । प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, हम Ca का उपयोग कर एक फोकल माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन2 + डाई Rhod-2/
Abstract
Ca2 + mitochondria द्वारा हैंडलिंग एक महत्वपूर्ण कार्य कोशिकाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में दोनों शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं को विनियमित है । सही करने के लिए प्रवाह की क्षमता और ca के समाप्ति2 + से mitochondria की भूमिका का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है mitochondrial ca2 + इन प्रक्रियाओं में हैंडलिंग । इस रिपोर्ट में, हम mitochondrial Ca के माप के लिए दो विधियाँ मौजूद2 + दोनों पृथक mitochondria और कल्चर्ड कक्षों में हैंडलिंग । हम पहले विस्तार एक प्लेट रीडर-mitochondrial ca को मापने के लिए मंच आधारित2 + सीए2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N का उपयोग कर ले । प्लेट रीडर आधारित स्वरूप विशेष उपकरणों के लिए की जरूरत को दरकिनार, और कैल्शियम ग्रीन-5N डाई आदर्श अलग ऊतक mitochondria से सीए2 + को मापने के लिए अनुकूल है । हमारे आवेदन के लिए, हम mitochondrial Ca के माप का वर्णन2 + mitochondria में ले लो माउस दिल के ऊतकों से पृथक; हालांकि, इस प्रक्रिया को मापने के लिए लागू किया जा सकता mitochondrial Ca2 + ऐसे जिगर, कंकाल की मांसपेशी, और मस्तिष्क के रूप में अंय ऊतकों से पृथक mitochondria में ले । दूसरे, हम mitochondrial ca के माप के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित परख का वर्णन2 + permeabilized कोशिकाओं में ca2 + संवेदनशील डाई Rhod-2/AM और 2-आयामी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग. इस permeabilization प्रोटोकॉल cytosolic डाई संदूषण समाप्त, mitochondrial Ca में परिवर्तन के विशिष्ट रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है2 +। इसके अलावा, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उच्च फ्रेम दर के लिए अनुमति देता है mitochondrial Ca2 + में तेजी से परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए विभिन्न दवाओं या बाह्य समाधान में लागू एजेंट के जवाब में + । इस प्रोटोकॉल को मापने के लिए लागू किया जा सकता mitochondrial Ca2 + ऐसे कार्डियक myocytes और न्यूरॉन्स, और अमर सेल लाइनों के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं सहित कई प्रकार के सेल में ।
Introduction
Mitochondria intracellular Ca2 + भंडारण और संकेतन की महत्वपूर्ण साइटों रहे हैं । अनुसंधान के दशकों का प्रदर्शन किया है कि mitochondria के लिए आयात और एकांत Ca2 + 1,2की क्षमता है । Mitochondria, हालांकि, केवल Ca के निष्क्रिय साइटों2 + भंडारण नहीं कर रहे हैं । Ca2 + mitochondrial डिब्बे में चयापचय उत्पादन और mitochondrial के सक्रियकरण-मध्यस्थता कोशिका मौत रास्ते, जो पहले से समीक्षा की गई है के विनियमन सहित मौलिक संकेत कार्य करता है3. चयापचय विनियमन के लिए, Ca2 + tricarboxylic एसिड चक्र के साथ ही श्वसन श्रृंखला परिसरों के तीन मैट्रिक्स-स्थानीयकृत dehydrogenases की गतिविधि को बढ़ाता है, mitochondrial ऊर्जा उत्पादन को बढ़ाने के लिए4,5 . mitochondrial ca के साथ2 + अधिभार और dysregulated mitochondrial ca2 + हैंडलिंग, ca2 + ट्रिगर mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (MPTP) खोलने, mitochondrial भीतरी झिल्ली permeabilization करने के लिए अग्रणी, झिल्ली संभावित हानि, mitochondrial रोग, सूजन, टूटना और अंत में, कोशिका मृत्यु6,7,8,9. इस प्रकार, mitochondrial Ca2 + संकेत सीधे चयापचय नियंत्रण और MPTP-मौत धुरी के माध्यम से सेलुलर जीवन और मौत रास्ते दोनों प्रभावों ।
हाल के वर्षों में, वहां तेजी से mitochondrial ca के अध्ययन में ब्याज का विस्तार किया गया है2 + बड़े हिस्से में गतिशीलता के कारण mitochondrial ca के आणविक घटकों की पहचान के लिए2 + uniporter परिसर, एक mitochondrial इनर झिल्ली ट्रांसपोर्टर कि Ca के एक प्राथमिक मोड है2 + mitochondrial मैट्रिक्स में आयात 10,11,12. uniporter के इन संरचनात्मक और विनियामक उपइकाइयों की पहचान के लिए आनुवंशिक रूप से लक्ष्यीकरण की संभावना आगे लाया गया है mitochondrial सीए2 + mitochondrial समारोह और शिथिलता मिलाना और के अध्ययन की सुविधा का तांता uniporter परिसर और mitochondrial Ca के योगदान2 + 13,14,15रोग के लिए आमद । दरअसल, mitochondrial Ca2 + संकेत हृदय रोग से neurodegeneration को लेकर रोगों की एक विविध सरणी के विकृतियों में फंसाया गया है, और कैंसर16,17,18, 19,20.
mitochondrial ca के मौलिक महत्व को देखते हुए2 + चयापचय और कोशिका मृत्यु में संकेतन, और जैविक प्रणालियों की व्यापक पहुंच के साथ संयुक्त है कि mitochondrial ca2 + संकेतन प्रभावों, विधियों का आकलन करने के लिए mitochondrial ca2 + आमद बहुत रुचि के हैं. आश्चर्य नहीं, तकनीक और उपकरणों की एक किस्म को मापने के लिए mitochondrial Ca2 + विकसित किया गया है । इन तरीकों कि फ्लोरोसेंट ca2 +-संवेदनशील रंजक21,22 और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ca2 + सेंसर mitochondria, जैसे cameleon और aequorin23के रूप में लक्षित के रूप में उपकरणों का उपयोग शामिल है, 24. इस अनुच्छेद के लक्ष्य के लिए विभिंन तरीकों और मॉडल सिस्टम जिसमें mitochondrial Ca2 + ले लो मापा जा सकता है पर प्रकाश डाला है । हम mitochondrial सीए2 + आमद क्षमता का आकलन करने के लिए दो प्रयोगात्मक तरीके पेश करते हैं । एक उदाहरण के रूप में कार्डियक mitochondria का उपयोग करना, हम विस्तार एक प्लेट रीडर-mitochondrial ca को मापने के लिए मंच आधारित2 + सीए2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N कि आदर्श पृथक ऊतक mitochondria के लिए अनुकूल है का उपयोग कर14 . NIH 3T3 कोशिकाओं का उपयोग करना, हम भी mitochondrial ca के माप के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग आधारित परख का वर्णन2 + permeabilized कोशिकाओं में ca का उपयोग कर2 + संवेदनशील डाई Rhod-2/
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम दो अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए उपाय mitochondrial Ca2 + आमद । प्लेट रीडर आधारित कैल्शियम ग्रीन-5N विधि extramitochondrial ca2 + स्तर पर नज़र रखता है और एक ca2 + है कि अच्छी तरह से अलग mitochondria में माप के लिए उपयुक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (J.Q.K.) से ग्रांट फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया ।
Materials
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
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