I betragtning af 3R-princippet, respiratorisk modeller som alternativer til dyreforsøg er under udvikling. Især for risikovurdering af respiratorisk stoffer er der en mangel på passende assays. Her, beskriver vi brugen af menneskelige præcision-cut lunge skiver til vurdering af luftbårne stoffer.
Respiratoriske sygdomme i den brede mangfoldighed har brug for passende modelsystemer til at forstå de underliggende mekanismer og muliggør udvikling af nye lægemidler. Desuden kræver registrering af nye stoffer passende risikovurdering med passende test systemer til at undgå risikoen for enkeltpersoner at blive skadet, for eksempel i arbejdsmiljøet. Disse risikovurderinger er normalt udført i dyreforsøg. På baggrund af 3R-princippet og offentlige skepsis mod dyreforsøg, menneskelige alternative metoder, såsom præcision-cut lunge skiver (PCLS), har været under udvikling. Den nuværende papir beskriver ex vivo -teknik af menneskelige PCLS at studere immunmodulerende potentiale af lav molekylvægt stoffer, såsom ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Målte slutpunkter omfatter levedygtighed og lokale respiratorisk betændelse, præget af ændrede sekretion af cytokiner og kemokiner. Pro-inflammatoriske cytokiner, tumor nekrose faktor alfa (TNF-α), og interleukin 1 alpha (IL-1α) var steget betydeligt i menneskelige PCLS efter udsættelse for en sub toksiske koncentration af HClPt. Selv om teknikken med PCLS er blevet betydeligt optimeret i de seneste årtier, er dens anvendelighed til afprøvning af immunomodulation stadig under udvikling. Resultaterne præsenteres her er derfor foreløbig, selvom de vise potentialet af menneskelige PCLS som et værdifuldt redskab i respiratoriske forskning.
Luftvejssygdomme såsom allergisk astma, arbejdsbetinget astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), emfysem, og infektioner i de øvre og nedre luftveje er stigende og udgør en verdensomspændende sundhed byrde1,2. Passende testsystemer er nødvendige for at identificere nogle af de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for disse sygdomme, ud over udviklingen og afprøvning af relevante stoffer. Grundlæggende forskning samt udvikling af prækliniske lægemidler er fokuseret på resultaterne opnået i mutagenicitetstest in vitro- eller i vivo . Disse assays, men har deres begrænsninger3. For det første, in vitro- assays udnytte menneskelige celler, der blev isoleret og fjernet fra tilstødende væv eller organer og er således ikke længere i stand til at interagere med eller være beskyttet af andre celler3. For det andet er dyremodeller ofte ikke oversættes til mennesker på grund af forskelle i fysiologi og biokemiske forskelle4. For at minimere disse begrænsninger, og i forbindelse med 3R (udskiftning, raffinement, reduktion) princippet5, nye alternative modeller under konstant udvikling.
Alternative menneskelige 3D væv modeller, såsom PCLS, er en forbindelse mellem menneske-baserede in vitro- og komplekse dyr i vivo modeller. PCLS afspejler den funktionelle heterogenitet med alle relevante celletyper i luftveje6. PCLS teknik har desuden fordelen, at reproducerbare forberedelse af flere tynde skiver af præcise tykkelse fra en enkelt menneskers eller dyrs vævsdonor. Dette giver mulighed for en intern kontrol samt forskellige koncentrationer eller narkotika skal testes.
Siden den første introduktion af agar-fyldt menneskelige lunge skiver i 1994 af Fisher et al. 7 teknik til udskæring og dyrkning af lungevæv er blevet væsentligt forbedret. Christian Martin et al. har forbedret denne teknik til yderligere kemisk og farmakologisk programmer8. Vores gruppe blev introduceret til denne teknik af Christian Martin i 2007. Siden da, har anvendelsen af PCLS i forskning udvidet fra test af funktionelle svar, såsom luftveje9,10 og vasokonstriktion11, til immunologiske, farmakologiske12,13, og toksikologiske7 test i forskellige arter i flere laboratorier. For eksempel, Schlepütz et al. 14 undersøgt luftvejene Svar nemlig arter forskelle og sammenlignet perifere neuron aktivering af elektrisk felt stimulation (EFS) eller af capsaicin i mus, rotter, marsvin, får, silkeaber og mennesker. De fandt de forskellige arter at have forskellige, men forskellige mønstre af nerve-medieret bronchoconstriction og konkluderede, at de almindeligt anvendte forsøgsdyr (mus og rotter) ikke altid afspejler den menneskelige reaktion. For lunge toksicitetstest og at reducere antallet af dyr i denne sammenhæng, Hess et al. 15 pre valideret rotte PCLS som ex vivo alternativ for indånding toksicitetstest. Denne polycentrisk pre-validering undersøgelse resulterede i udviklingen af to forudsigelse modeller ved hjælp af PCLS med lovende resultater.
Desuden, i grundforskning, PCLS har været brugt til at belyse calcium signalering16, tidlig allergiske reaktioner17og viral infektion svar18,19. Tekniske fremskridt foregår løbende og yderligere forskud er ved at blive undersøgt. For eksempel, stiger feltet gavn for humant væv med opbevaring og genbrug af frossen væv. Rosner et al. beskrev en teknik til nedfrysning og optøning murine PCLS, der bevarer evnen af luftvejene til kontrakt ved stimulation: derfor teknikken forlænger vinduet begrænset tidsrum inden for hvilket væv forbliver levedygtig, og så videre assays kan anvendes over tid på den samme donor20. Ud over disse forskning forskud, Lauenstein et al. 21 for nylig undersøgt risikovurdering af forskellige kemikalier, der kan fungere som potentielle sensibiliserende for arbejdsbetinget astma i menneskelige PCLS.
Arbejdsbetinget astma, hvis symptomer er airflow obstruktion og luftvejene hyperresponsivitet, svarer til allergisk astma, er forårsaget af eksponering for høj molekylvægt (HMW)22 eller lav molekylvægt (LMW) stoffer23 (f.eks. , platin forbindelser) i arbejdsmiljø. LMW agenter har en høj sensibilisering potentielle når danner habtener og binder til transportøren proteiner21. Registrering af nye HMW eller LMW kemikalier kræver in vitro og i vivo risikovurdering vedrørende deres formodede sensibilisering potentielle (fx., OECD Guideline 429)24. De test, der anvendes til at bestemme den formodede sensibilisering af potentielle, dog blev oprindeligt ikke udviklet for risikovurdering af respiratorisk sensibiliserende, men for kontakt sensibiliserende, men der syntes at være nogle kongruens for en lille delmængde af stoffer25 . Arbejde af Lauenstein et al. var designet som en del af EU-projektet Sens-it-iv, til at udvikle alternative teststrategier for risikovurdering af formodede kontakt eller lunge sensibiliserende21. Til dette projekt fokuseret vi på teste anvendeligheden af menneskelige PCLS som en alternativ test værktøj. Derfor, et sæt af immunmodulerende slutpunkter (fx, levedygtighed og cytokin sekretion) blev valgt til at bestemme den irriterende eller inflammatorisk potentiale for kemikalier, såsom LMW platin forbindelser. Lauenstein et al. fandt ingen generelle mønster, der kan anvendes til alle respiratorisk sensibiliserende; deres arbejde leveres dog grundlaget for nylig publicerede protokoller26.
I Resumé giver protokollen præsenteret her for forberedelse og efterfølgende eksponering af menneskelige PCLS en nyttig metode til evaluering af potentielt lunge-giftige og/eller immunmodulerende stoffer, der kan være involveret i udviklingen af respiratorisk sygdomme, som arbejdsbetinget astma.
Den menneskelige PCLS teknik er veletableret i vores laboratorium. Den nuværende papir giver en beskrivelse af denne teknik og dets anvendelse til toksicitetstest af stoffer i lunge væv ex vivo. Generelt, relateret enhver laboratorium ved hjælp af denne teknik bør søge at oprette en assay definition af kvantificerbare intervaller, estimering af variabilitet og kvalitetskontrol sikrer gyldigheden af eksperimentet. Mulige standard procedurer kunne være, for eksempel, at gentage hvert slutpunkt, fxcytotoksicitet assay, i mindst tre biologiske donorer (enkelte kørsler) med et minimum af to til tre tekniske replikater pr. prøve herunder positive og negative referencer. Laboratoriepersonalet skal uddannes til at øge assay konsistens og minimere assay variation.
Slutpunkter, der ofte bruges til at vurdere immunmodulerende virkninger af stoffer på lungevæv omfatter cytotoksicitet målinger ved hjælp af forskellige assays (fx, LDH assay, WST-1 assay, mikroskopiske farvning assay), cytokin release undersøgelser, såvel som ændringer i udtryk profil og karakterisering af ændringer i cellulære populationer af immunohistopathological metoder6. Desuden er der teknikker der beskriver visualisering af celler, såsom pulmonal dendritiske celler, i murine PCLS28 , der kan også overføres til menneskelige PCLS og kan dermed give mere detaljeret indsigt i den cellulære sammensætning før og efter behandling med formodede cytotoksiske stoffer.
Denne grundlæggende protokol og teknik til præparation af menneskelige lunge væv sektioner er sammenlignelig med teknikker, der har været godt beskrevet i publikationer29. Kort sagt, er orgel materiale fremstillet af patienter lider af live-truende kroniske sygdomme som lungekræft, der opereres for resektion eller transplantation. Undersøgelserne skal godkendes af det lokale etiske udvalg. Patienternes informeret skriftligt samtykke er påkrævet. At oprette en arbejdsproces mellem klinik og laboratorium er et kritisk spørgsmål og kræver kommunikation, og definitionen af grænseflader og infrastruktur mellem begge steder. Menneskelige lunge materiale har skal behandles direkte efter resektion at bevare levedygtigheden af væv. Det er værd at nævne, at den teknik beskrevet her for menneskelige PCLS kan anvendes til både unge og gamle lunger og raske og syge lunger. I USA, for eksempel, er det muligt at få lungerne fra sunde organdonorer, der døde i ulykker eller hvis organer er blevet afvist til transplantation.
Det første vigtige skridt i protokollen er inflation i luftvejene og omkringliggende parenkym med Agarosen løsning. Dette trin er nødvendigt at befæste de meget bløde væv for den efterfølgende procedure, udskæring. Kvaliteten af menneskelige lunge materiale, baseret på sygdom baggrunden, er afgørende her. Kun lapper med intakt lungehinden kan udfyldes. Slutstadium tumorer nær Bronkie forhindre nogle gange fyldet processen. Inden oppumpning af humant materiale, har temperaturen af løsningen ved agarosegelelektroforese skal kontrolleres grundigt. For meget blod (eller andre væsker, ekssudater) inde i menneskelige lungevæv vil resultere i uønskede fortynding af Agarosen og vil påvirke polymerisering processen. Efter inflationen af lungevæv og geldannende af Agarosen på is, skæres lungerne i sektioner af 200 til 300 µm tykkelse. Konsekvens af væv er et meget kritisk spørgsmål. Hvis væv er for blød, er udskæring af lige dele vanskelige. Selv om samme mikrotom-parametrene er angivet for hver donor, tykkelsen af skiverne er mellem donorerne kan variere, grund af individuelle forhold og ændringer under den oppumpning proces for hver lunge. Inhomogene påfyldning af væv vil resultere i forskellige skive tykkelser. I stedet for at måle og standardisere tykkelsen på skiver, kan måling af samlede proteinindhold bruges til indirekte overvåge lunge skive tykkelser. Flere slutstadiet sygdomme hæmme udskæring processen; f.eks, blod fartøjer er meget fortykket i pulmonal hypertension og fibrotisk væv kan være så stive, at udskæring af væv cylindre er næppe muligt og mikrotomen blade skal udskiftes meget ofte.
Efter udarbejdelse af menneskelige PCLS og intensiv vask trin, som er nødvendige for at fjerne celle debris og udgivet enzymer, væv sektioner kan bruges til eksperimenter29. Menneskets PCLS er kulturperler under normal celle kultur betingelser og udsat, for eksempel, kemikalier, lægemidler eller lipopolysaccharides. Lejlighedsvis forurening af PCLS på grund af (ukendte) infektioner er en særudgave på kultur af human lunge materiale. Vævskulturer viser infektioner skal kasseres og udstyr skal desinficeres grundigt. Fysisk adskillelse mellem laboratorium steder bruges til forberedelse på den ene side og dyrkning kan på den anden side bidrage til at undgå cross-infektioner. Med hensyn til udstyr, mikrotomen kan lække og løs hex skruer kan føre til motor skader og stop klinge bevægelighed. Ikke alle dele af udsnitsfilteret er lavet af rustfrit stål, og så det vil oxidere hvis ikke tørres straks ændre rengøring. For at overvinde udstyr spørgsmål, kan det være nødvendigt at have mindst én sikkerhedskopieringsenhed.
I tidligere publikationer, Agarosen rapporteret at blive renset og fjernet under intensiv vask trin efter tilberedning. Faktisk er det ikke muligt, at Agarosen kan ikke fjernes. For fuldstændig fjernelse af agarosegelelektroforese skal det være re smeltet ved høje temperaturer, som ville ødelægge vævet. Agarosen i alveolerne og luftvejene interfererer ikke med de beskrevne slutpunkter. Andre slutpunkter kan påvirkes af tilstedeværelsen af Agarosen (Se også begrænsninger). Behovet for at forberede meget frisk væv sektioner har understreges, da væv levedygtighed er et kritisk spørgsmål i kultur. Bronchoconstriction er ikke en gyldig parameter for bæredygtighed. Vi anbefaler at bruge mindst to eller tre uafhængige cytotoksicitet assays til at kontrollere levedygtigheden af de omkringliggende parenkym; Dette har at være kontrolleret i hvert eksperiment30. Kvalitetskontrol i cytotoksicitet assays tjene som indikatorer for utilstrækkelig væv levedygtighed. Det anbefales derfor, at vurdere lydhørhed af væv, for eksempel, at en effektiv giftigt stof såsom et rengøringsmiddel i alle cytotoksicitet assays. Baseret på dosis-respons-kurver, mindste og største værdier af absorption skal defineres for cytotoksicitet assays og mødte for efterfølgende forsøg. Yderligere ændringer til protokollen afhænger for det meste af de anvendte kemikalier og slutpunkterne på interesse. Anvendeligheden af uopløselige eller meget reaktive kemikalier er begrænset. Den højeste opløsningsmiddel koncentration af DMSO er begrænset til 1%. Højere koncentrationer kan bruges, men kan resultere i udtales udgivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner som IL-8. På den anden side kan den stimulus anvendes være relativt svage. I dette tilfælde kan væv forhøjes fra to til fire skiver pr. brønd. Denne tilgang begrænser levedygtighed til 24 h.
En stor begrænsning af menneskelig PCLS er, at i Tyskland de kan kun fremstilles af syge menneskers lunge materiale. Patienter, der gennemgår kirurgi er normalt ældre end 50 år og 80% af patienter med lungekræft er eller plejede at være rygere. Medicinsk behandling af patienter, som glukokortikoider, kan også påvirke resultatet af eksperimenter med humant væv. Derfor er det vigtigt at: i) validere hvert eksperiment af positive referencer kontrollere bæredygtighed, funktionalitet og følsomheden af de enkelte væv, og ii) Kors-validere resultaterne ved hjælp af sund, ikke-syge, midaldrende lungevæv fra forsøgsdyr (ikke-menneskelige primater såsom cynomolgus og, hvis det er muligt, mus, rotter, marsvin). Jo bedre patologi score på det syge væv, jo bedre de eksperimentelle resultater. Stærkt sygt væv kan næppe bruges og meget ofte viser begrænset levedygtighed, utilstrækkeligt lav eller meget høj cytokin niveauer, bakterie- eller svampeinfektion infektioner og mindre bronchoconstriction. Donor-til-donor variation er højere sammenlignet med resultaterne fra forsøgsdyr, som afspejler den individuelle variation af mennesker. Dette er dog ikke en begrænsning i almindelighed; som nævnt ovenfor, i andre lande (fxUSA) det er muligt at opnå sunde lunger fra afdøde organdonorer afvist til transplantation. Lydhørhed af væv er blevet godt beskrevet for den første op til 48 h i akut eksponering eksperimenter. Levedygtighed og funktionalitet af væv er reduceret efter mange dage af kultur eller efter oplagring ved-80 ° C. Det er muligt at kultur menneskelige lungevæv for op til ca. 14 dage. Levedygtighed fortsætter i løbet af denne tid; imidlertid er en stigning i variabilitet, såvel som et tab af funktionalitet af adskillige cellepopulationer, såsom makrofager, i væv observeret, hvilket resulterer i begrænset cytokin udgivelse i svar til mitogens. En anden begrænsning for nogle slutpunkter er tilstedeværelsen af Agarosen i væv, hindre, for eksempel, isolering af høj kvalitet og tilstrækkelige mængder af RNA31 eller forberedelse af encellede suspensioner for efterfølgende flowcytometri og fænotyper af celler. Mulighed for at få mekanistiske indblik i én celle svar og funktionalitet er dermed begrænset.
Organotypic væv modeller, såsom menneskelige PCLS, anses for at have en stor indvirkning på grundlæggende og ikke-kliniske forskning. Menneskelige lunge materiale har en biologisk sammensætning, som nøje afspejler den normale organ arkitektur. Det indeholder for eksempel boliger alveolær og bronchiale epitelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, endotelceller, nerve fibre og makrofager. Vævet er levedygtig og celler reagerer på flere stimuli. Nerve fibre, selvom klippe, kan være lokalt aktiveret, fører til terminal refleks svar14. Derfor tilbyder denne ex vivo -model muligheden for at studere cellulær medfødte immunrespons, forsvar svar, cytokin signalering og induktion af celle overflade markører. Flere forbedringer i teknik, dyrkning og validering af slutpunkter tillade brugen af menneskelige PCLS i translationel videnskab. Eksempler på fremtidige tilgange er: i) validering af nye mål i menneskelige lungevæv, ii) vurdering af immunrespons efter eksponering, for eksempel, kemikalier, lægemidler, nanopartikler, osv., iii) tilskud af lungevæv med immunceller, sådan som T-lymfocytter, iv) identifikation og ændring af molekylære mønstre, for eksempel, efter udsættelse for respiratorisk sensibiliserende, sygdom-fremkaldende stoffer eller aktive forbindelser hæmme veje; Derudover v) luftvejene remodellering og vi) neuronal forordning32. Det videnskabelige felt er interesseret i disse nuværende og fremtidige strategier med PCLS. Derudover findes en række forskellige udviklinger, der vil bidrage til at forbedre PCLS teknik, såsom cryo-bevarelse20og væv stretching33 for at efterligne den naturlige bevægelse af væv under vejrtrækning eller mekanisk ventilation.
Den største fordel ved menneskelige PCLS sammenlignet med andre 3D modeller er tilstedeværelsen af immunceller og nervefibre. Eksperimenter kan også udføres i mus, rotte, og ikke-menneskelige primater, der er de dyrearter, der stadig bruges oftest i farmakologi og toksikologi. Kompleksiteten af menneskelige lungevæv understøtter oversættelse af resultater fra dyr til menneske og fra in vitro- til in vivo. I forbindelse med eksisterende alternative assays til identifikation af respiratorisk sensibiliserende, menneskets PCLS er meget kompleks og tillader ikke indsigt i enkelt celle svar. Endnu, mikroskopi og flow flowcytometri kan give oplysninger om cellulære svar, hvis den lige cellulære markør bruges i kombination, for eksempel med apoptose, nekrose eller intracellulære markører. Der er publiceret assays, som er godkendt og rapporteret at have været anvendt til identifikation af respiratorisk sensibiliserende. Men fremskridt inden for brug af PCLS med alle deres fordele i forhold til én celle assays gør et værdifuldt bidrag i den forstand, at teknikken kan bruges til high throughput screening, som beskrevet af Watson et al. 34 de udviklet en høj overførselshastighed screening assay for at forudsige luftvejene toksicitet i murine cryo-konserveret PCLS. Med deres miniaturized 96-brønd PCLS format påvist de lignende udlæsninger i murine lavage væske, hvilket gør PCLS en gennemførlig høj overførselshastighed assay.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Lan Lauenstein for hendes forudgående arbejde vedrørende alternative teststrategier for risikovurdering med menneskelige PCLS. Nogle af forskningen blev støttet af en bevilling fra Europa-Kommissionen i 6th ramme programmet SENS-IT-IV “Roman test strategier for In vitro- vurdering af allergener”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |