人精切肺切片中物质的细胞毒性及免疫调节作用的评价

人类 PCLS 的实验必须按照世界医学协会的道德准则进行, 并由地方伦理委员会批准 (这里所示的模范 PCLS 实验是由汉诺威地方伦理委员会批准的。医学院;2701-2015 号)。所有捐献者或其近亲都需要书面知情同意使用人肺材料。本手稿中所述的结果与不同年龄、性别、病史和切除原因的捐献者组织切片获得, 但大多数接受的组织来自肺癌患者。只有无肿瘤组织被用于实验。 1. 人类 PCLS 的一般准备和随后对化学品的接触 注: 两人需补肺。建议提供最新的 A 型肝炎和乙肝疫苗接种记录。患者在肺移植前例行筛查 HCV 和 HIV 病毒。如果诊断或怀疑患有结核分枝杆菌的活动感染, 应拒绝使用肺。然而, 所有新鲜的人肺组织和从它提取的样品必须被对待作为潜在传染性和相应的保护措施必须采取 (微粒过滤器面具 (FFP2), 防护眼镜, 手套) 保证职业安全员工。过程需要 60-90 分钟。 确认人肺叶的完整性。注: 胸膜中的泪可防止组织的均匀充填。人肺材料必须从切除之日起。贮存期约2小时室温 (RT) 之前, 填补它与琼脂糖在冰上耐受。我们在这个协议中使用的组织是从接受切除手术的病人那里得到的。它不是从已故的病人。如果该组织已储存在冰上, 预先预热到 RT, 然后再填充, 否则琼脂糖将立即聚合, 没有均匀灌装将是可能的。注意: 确保所有与当地人类材料接触的人都穿上防护服, 包括实验室大衣、两副手套、帽子、面罩和一副安全眼镜。人体材料具有潜在的传染性。 重7.5 克的低凝胶琼脂糖, 并添加到250毫升的双蒸馏水。在微波炉中煮沸琼脂糖, 直到琼脂糖溶解。冷却它到大约40°c, 取决于琼脂糖的熔化和胶凝点。注: 需要几个烧瓶, 这取决于裂片的大小。 预热并保持培养基 (材料表) 在摄氏37摄氏度。注: 如果琼脂糖太热, 培养基中的维生素会失去功效, 细胞会受损。如果培养基/琼脂糖溶液的温度低于37摄氏度, 胶凝过程将开始并损害肺的均匀充填。仅温度范围的37°c 到39°c 推荐。 在开始之前将所有必需的材料放置在所需的范围内: 5-10 夹子, 大约 1 m 长度的灵活的导管, 适当的注射器 (例如, 50 毫升) 适合与导管的连接, 并且一个装满冰的冰盒。 Cannulate 气管/主支气管插入硅胶管并将其固定在平行于管的夹钳上, 使钳夹与硅胶管一起挤压组织, 而不将其捏紧。验证硅胶管是否固定在内, 在灌装过程中不能溜出。关闭所有其他支气管, 血管和损伤与夹子, 以便没有琼脂糖可能漏出在灌装过程中。 在烧杯中混合3% 低凝胶琼脂与培养基的等效体积。用50毫升的注射器将混合物注入肺部。在用培养基填充注射器之前, 钳夹用手指或钳封住导管, 以避免气泡和琼脂糖回流。把肺瓣填满, 直到它完全充气。小心地触摸侧面的肺部胸膜;胸膜应该是坚硬的。注: 根据肺瓣的大小, 可要求2或3升琼脂糖/中等溶液。 重复步骤 1.5-1.6 为每个支气管的情况下, 几个支气管在一个单一的标本。 将肺放在冰上, 以凝胶的聚合为 20-40 分钟, 这取决于注入琼脂糖的数量。仔细接触几面的胸膜, 检查它是硬的还是凉的, 表明聚合是完整的, 否则继续等待。让病理学家将肺切成薄片, 取标本, 将肺材料储存在冰上进行运输。 用锋利的刀子将人肺组织切成 3-5 厘米的石板。注: 使用新刀片, 每肺, 以确保锐度。 用400毫升冰冷的厄尔平衡盐溶液 (EBSS) 填充组织切片器。用一个半自动螺丝刀将圆柱形的组织芯从肺部板上切开, 用一个具有优选直径的取心工具 (例如, 8 毫米; 10 毫米)。注: 此直径必须与机器内的组织支架直径相等。 将肺切片的厚度调整为所需的厚度值。注: 在 PCLS 实验中通常使用大约250µm 的厚度。组织切片器的制造商推荐他们的组织切片厚度表来验证切片厚度。另外, 全装染色结合共焦显微术可用于确定切片厚度, 如 Brismar et . 所述。27 将组织芯转移到组织切片器的组织支架中。把重量 (部分的组织持有人) 放在组织核心的顶端。在组织切片器上设置臂速度和刀片速度为6。开始把组织核心切成 PCLS。 补充500毫升商用 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM): 营养混合物 F-12 DMEM/F12 (1:1) 与5毫升的青霉素 (1万单位/毫升) 和链霉素 (1万µg/毫升)。在冰箱的无菌条件下贮存培养基数天。预热只需要介质的体积。注: 青霉素将被灭活, 如果保持在37摄氏度长的时间。使用无血清和无染料培养基, 因为血清成分的变化从批次到批次和染料, 如酚红色, 可以干扰化验。 用25毫升冰冷培养基填充培养皿 (100 x 15 毫米)。介质应从组织切片器中排出, 通过打开玻璃筒的夹钳进入烧杯。使用施药器 (例如, 接种回路) 将从烧杯中的切片转移到培养皿中。将培养皿放入孵化器 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿度)。允许介质在洗涤步骤前预热。注意: 所有进一步的步骤都是在无菌条件下进行的。 把一个细胞过滤器放进培养皿里洗 PCLS。通过细胞过滤器完全去除培养基与10毫升血清吸管, 并添加25毫升37°c 预热新鲜培养基。重复此步骤 3-4 次每30分钟。注: 细胞过滤器防止切片被吸入吸管, 以避免对切片的任何损害。 将肺切片小心地转移到一个24井培养板中, 其中至少有500µL 培养基, 每条井两片。将肺组织暴露在物质上 (见步骤 3.1-3.4),例如, 24 h 在37摄氏度, 5% CO2。注: 对于转移, 最好使用接种循环, 让切片漂浮到循环, 以防止组织损害。不需要进一步分离切片, 因为只有缺乏足够的新鲜培养基会诱发细胞死亡的组织切片。切片可以在井中互相重叠或相互接触: 这对组织的生存能力没有影响。 将所有剩余的人体材料放入一个带有固定剂的塑料瓶中 (例如, 10% 缓冲甲醛), 至少24小时, 并在处置过程中烧掉。注意: 甲醛是有毒的, 在罩下执行此步骤。 2. PCLS 的组织学分析 用两个泡沫垫浸泡在固定体中 (e. g, 4% 缓冲甲醛) 制备活检盒。将 PCLS 放在活检盒中的泡沫垫之间, 并立即将组织转移到固定液中。用4% 缓冲的甲醛固定组织过夜。 在乙醇 (70%、90%、100%、100%、100%、100%) 中, 用脱水样品处理石蜡嵌入的组织, 然后分别在二甲苯 (1 x 3 h) 和液体石蜡 (1 x 3 h) 中洗涤, 按标准的病理组织学规程。 将 PCLS 转移到嵌入模具中。使用接种循环。在液体石蜡中嵌入 PCLS 组织。在铸造石蜡块时, 一定要把组织均匀地放在模具中。 用旋转切片切开含有 PCLS 的组织块, 直到它有平坦甚至表面。取所需厚度的串行部分 (e. g, 4 µm), 分别放置在连续编号的镀膜玻璃幻灯片上 (通常可采用 25-30 节), 直到整个 PCLS 处理完毕。 着色单玻片 (每 8-10 节) 与苏木精和红红染色 (H & E) 为取向。根据方向幻灯片为实验选择节 (第一个和最后8个部分通常不完整)。注: (可选) 用于长时间贮存, 可将滑块浸在液体石蜡中以保存。 3. 制备物质溶液 注: 在使用前应立即准备工作解决方案和控制。 注意: 根据安全指示处理物质, 如果不知道, 可能有害, 并遵循常规安全预防措施。 直接在培养基中溶解水溶性物质。对于不溶性或不易溶解的化学物质, 首先根据物质溶解度将物质溶解于适当的溶剂中。水溶解度有限的物质 (< 0.1 毫克/毫升) 可以溶解, 例如, 在亚砜或乙醇。非毒性溶剂浓度应预先测定。在稀释成培养基时, 要确保物质不会沉淀出溶液。注: HClPt 和 laureth 硫酸钠 (SLS) 溶液的制备。 在培养基或溶剂中所需最高浓度的100倍处制备物质库存溶液。重12.5 毫克 HClPt 和34.4 毫克 SLS, 并通过溶解化学物质在1毫升培养基中制备库存溶液。注: 这些化学品不需要溶剂。 在预热培养基中准备最后稀释1:100。在使用溶剂之前, 这种方法会导致所有物质浓度的最终溶剂浓度相同。 使用最后的溶剂浓度 (如步骤3.3 所述的例如, 1%) 进行 PCLS 的参考治疗。结果部分提到的化学品不需要进行溶剂控制。 4. 细胞毒性测定的阳性和阴性参考文献 对于所有可行性化验, 准备以下积极和消极的控制: 组织控制: 培养培养基中的 PCLS 在细胞培养条件下仅为24小时未治疗 PCLS 的参考 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿度)。 车控制 (如果需要): 孵化 PCLS 以最后的溶剂集中作为参考为 PCLS 仅处理与车 (参见步骤 3.4) 为 24 h 在细胞培养条件 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿气)。 积极控制: 孵化 PCLS 与1% 洗涤剂在缓冲液1小时在4摄氏度。注意: 如果 PCLS 变成无色, 组织就死了。l-乳酸脱氢酶 (LDH) 在上清液中测定, 吸收约 1.9-2.3 (见步骤 6.1-6.4)。该组织用于 WST-1 化验 (见步骤 5.1-5.5), 吸收约0。 5. WST-1 法测定人 PCLS 中化学诱导的细胞毒性 注: WST-1 试验是在24井板上进行的, 每井两 PCLS。最好对每个参数使用重复项, 并在测量后将这些重复项的结果汇集在一起。 在启动前立即稀释 WST-1 试剂, 准备工作溶液。所需的工作溶液量是一个24井板的250µL/井。因此, 混合25µL 的试剂与225µL 的培养基为一井。 PCLS 从步骤1.16 孵化后, 丢弃或使用上清液进行细胞因子测量或其他试验, 如 LDH 测定。其余的组织用于下一步。 吸管250µL 的工作浓度的 WST-1 试剂每井和孵化板在37°c 和 5% CO2 1 h. 确保 PCLS 在孵化过程中完全由 WST-1 试剂覆盖。 将盘子放在一个轨道振动筛上 (200 rpm), 并在三十年代仔细摇动以确保 WST-1 试剂的彻底混合。取一个新的平底96井板和吸管100µL 在重复从每个井的24井板。 用微板块读取器测量每个井在 450 nm (参考: 630 nm) 的吸收。减去吸收在630毫微米从450毫微米。这些值将用于步骤5.6 中的计算)。注: 只有在可行的组织中才能获得可靠的细胞毒性评估数据。因此, 这些验收标准由赫斯等。每个实验中都应满足15的需要。如果不符合这些标准, 则应重复试验。 对未经处理的培养基控制的吸收应在0.6 以上, 否则应重复试验。如果数据符合这一要求, 将组织控制的吸收值设置为 100%, 并计算与组织控制有关的治疗样品的 WST-1 减少。 6. 乳酸脱氢酶测定 注: 乳酸脱氢酶测定是在96井板中进行的, 在潜伏期后总共有100µL 培养上清液。 在 PCLS 或没有检测剂孵化后, 从步骤1.16 中取50µL, 并将其复制到新的96井板中。这将产生重复从每个处理好的24井板。 在化验前立即准备乳酸脱氢酶试剂的工作溶液。工作解决方案包括催化剂溶液 (lyophilisate 溶解在1毫升 bidistilled 水) 和染料溶液由制造商提供。对于一个96井板, 彻底混合125µL 的催化剂溶液与6.25 毫升的染料溶液。注意: 不要将解决方案暴露在直接光线下。 吸管50µL 的工作解决方案, 在每个井已经包含了50µL 的上清和孵化的板块20分钟在 RT 在黑暗中。不需要进一步混合。 用微板块读取器测量每个井在 492 nm (参考: 630 nm) 的吸收。减去吸收在630毫微米从492毫微米。这些值将用于步骤6.5 中的计算。注: 只有在可行的组织中才能获得可靠的细胞毒性评估数据。吸收洗涤剂处理的控制应超过1。 为分析, 将正控制的吸收值从步骤4.1 设置为 100%, 并计算与正控制 (即, 最大 LDH 释放) 有关的待处理样本中的 LDH 释放量。 7. 共聚焦激光扫描显微镜 (cLSM) 显微生存能力测定 注: 对于显微生存能力检测, 两个正常的 250-µm 厚 PCLS 染色250µL/井24井板。由于每个切片都是单独映像的, 因此不需要再重复。 在 PCLS 或无试验项目孵化后, 丢弃上清液或用于细胞因子测量或其他试验, 如 LDH 测定。请使用其余的组织来说明这里描述的过程。 准备 calcein 和溴 homodimer 1 (EthD-1) 的工作稀释, 并在培养基中使用4µM 的两种试剂的工作浓度。为此, 添加1µL 的 calcein (4 毫米) 和2µL EthD-1 (2 毫米) 到997µL 培养基。这卷是需要4井染色与两个 PCLS 每个。注意: 避免接触到直接光的试剂。 吸管250µL 的工作稀释在每个井和孵化24井板45分钟在 RT 在黑暗中。在孵化过程中, 将盘子放在 150 rpm 的轨道振动筛上, 以确保组织更好地接触染色液。 45分钟后, 丢弃染色液, 用1毫升缓冲液清洗 PCLS, 并在黑暗中在 RT 上以 150 rpm 为 3-5 分钟进行抖动。重复此步骤两次。 将500µL 的缓冲液应用于含染色 PCLS 的每一井, 以避免培养基中的自体荧光。对于显微评估, 至少执行两个随机分布的 z 栈与 cLSM。 点击眼睛标签选择 10 x/0.3 目标, 并点击在线使用 cLSM 作为一个标准的光显微镜, 以找到 PCLS 的表面。单击 “脱机” 退出 “眼部” 设置。 点击采集标签, 打开合适的激光显影。注: 我们使用了一个波长为 488 nm 的氩激光器, 用于聚阴离子染料 calcein (495 nm 的激发波长) 和 HeNe 激光器, 波长为 543 nm, 用于检测 EthD-1/DNA 复合体 (533 nm 的激发波长)。氩激光器一般应运行在最大电流的 30-50%, 使管电流的约 5.7 a, 因为这延长了激光寿命显着。 单击获取选项卡下的光路径, 并为实验设置必要的筛选器和镜像。注: 在本研究中, 采用基于过滤器的系统与主分色光束分配器 (e. g, 高频 488/543) 分离激发和发射光。通过反射镜, 这盏灯被定向到二次分色分束器 (例如, 测试 545), 以进一步将从样品中发出的光分离成两个通道。 设置带通滤波器 (例如, bp 505-530 用于 calcein 信号和 bp 560-615 EthD-1/DNA 复杂信号), 仅传输一定范围的波长, 并将 calcein 信号分配给信道2和 EthD-1/DNA 复杂信号到通道3。 检查 Z 堆栈框, 以设置微观体积的上下限。按 “实时” 按钮可查看屏幕上相应图层的实时视图。向上或向下移动焦点以发现 PCLS 的表面带有尖锐的信号。 单击通道小节并选中全部显示框。按下现场图像下方相应通道的按钮, 并激活通道颜色, 锁定表。注: 在现场图像中的蓝色将表明没有信号, 而高信号将出现在白色和过度曝光的信号将出现在红色。 将红色 EthD-1 通道的针孔设置为1通风单元, 以便在光收集和光学切片效率之间进行最佳权衡, 并相应调整 calcein 通道。增加检测到的增益信号, 使其在带有激活通道颜色锁定表的实时图像中显示为白色而不是红色。注: 主增益不应超过600单位。 增加或减少数字偏移量, 以调整背景, 使其在带有激活通道颜色锁定表的实时图像中以蓝色显示。 在多维获取下单击 z 堆栈选项卡, 并使用焦点移到感兴趣的 z 层。按设置优先以保存此位置以供以后获取。将焦点缓慢地向上或向下移动, 直到达到30µm 的范围, 然后按设置最后保存。 再次单击实时以停用实时图像, 然后按开始实验开始成像。注意: 聚阴离子染料 calcein 的荧光检测可存活组织。死细胞被 EthD-1 和核酸的复杂形成所歧视。 8. 图像渲染 注意: 图像渲染软件的计算机推荐必须考虑到, 因为这个程序需要适当的硬件。 加载从 PCLS 的微观生存能力染色获得的 LSM 文件 (参见7节) 到图像渲染软件中。在继续之前将其保存为. ims 文件。设置组织控件上的所有参数, 并将其应用于所有图像。不允许进行进一步的更改。 使用 “音量” 按钮进行有效组织的表面重建 (calcein 染色) (辅助图 1A) 和死细胞核的斑点按钮 (补充图 1H)。呈现一个通道时, 在 “显示调整” 窗口中关闭其他通道。 从渲染生命组织的体积开始: 设置曲面的通道, 处理整个图像, 将平滑因子设置为0.5 µm, 并使用绝对强度阈值 (辅助图 1B, C)。按蓝色正向箭头。 调整重建体积的绝对强度阈值;应减去噪声和背景强度。表面叠加显示为灰色, 应检查表面覆盖的准确性 (辅助图 1D)。完成调整后, 按蓝色正向箭头。大多数情况下, 此步骤是计算设置所必需的。如果软件不能计算体积, 增加平滑系数。 在最后一步中, 选择一个筛选器。使用球形过滤器 (约10µm) 进行表面渲染, 滤除肺泡空间中的巨噬细胞 (补充图 1E)。按绿色正向按钮。 光学上调整输出图像和导出统计信息作为. xls 文件。总容积 (总和) 将用于进一步分析 (补充图 1F, G)。保存设置并使用相同的 cLSM 设置 (辅助图 1I) 在同一天进行的所有 z 堆栈的进一步分析。 重建死细胞核的红色通道 (斑点)。在超越窗口中随机测量µm 缩放的点大小;网点大小约为5µm. 标记启用并设置点大小。检查是否所有点都被标记, 每个点只计算一次。如果需要, 请手动更正 (补充图1B、H、J)。按蓝色正向箭头。 按 “绿色前向” 按钮, 让程序根据设置的参数计算/计数总斑点数, 并将结果导出为. xls 文件 (补充图1K、L、M)。对于图像的图形或统计分析, 将计算出的死细胞核的数量与生命组织的体积比例进行了比较。 9. 人 PCLS 中细胞因子和趋化因子的测定 注: 细胞因子和趋化因子免疫应答可在培养时间后 extracellularly 在组织裂解物中的培养基上清和 intracellularly 中测定。ELISA 是以重复的96井板和100µL。 通过将5毫升洗涤剂与495毫升的缓冲液混合, 制备1% 洗涤剂溶液。该解决方案可以在 RT 中存储几个月。 将1% 洗涤剂溶液与蛋白酶抑制剂 (PI) 混合, 比例为1:500。所需数量取决于培养板;例如, 使用500µL/井的24井板。对于一个井, 混合1µL 的 PI 与499µL 洗涤剂溶液。 用1µL 的 PI 溶液制备管, 在这些试管中收集500µL 的培养上清液。立即更换24井板中的介质, 用500µL 洗涤剂溶液, 其中含有 PI, 如步骤9.2 所准备。溶解组织为 1 h 通过放置24井板在4°c。吸管的组织裂解在一个新的管和存储这些管在-80 °c, 直到进一步分析。注: ELISA 协议高度依赖制造商和制造商的指示应遵循。下面介绍了标准 ELISA 协议。 根据制造商的指示, 执行 ELISA 测量上清或裂解液中的细胞因子水平。为了测量 IL-1α和 TNF α, a96-well 板吹打100µL 的捕获抗体 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化过夜在 RT。 在1升 bidistilled 水中溶解洗涤缓冲片, 准备洗涤缓冲器。删除捕获抗体和吸管400µL 洗涤缓冲区到每个井。更换此卷三次。根据制造商的说明, 在缓冲区解决方案中添加阻塞解决方案 (例如, 1% BSA) 来阻止该板块。在 RT 中孵育1小时。注: 标准商用 ELISAs 需要 2 x 100 µL 的组织上清或裂解。样品应解冻一次, 并在使用之前。根据检测的敏感性和释放的细胞因子, 样品必须在测量之前稀释。因此, 在化验所提供的试剂中稀释样品。 删除阻塞解决方案, 并添加稀释样品的标准曲线 (稀释遵循制造商的指示) 和100µL 组织上清或100µL 组织裂解在重复收集在步骤9.3。在 RT 中孵化2小时。 将样品和吸管400µL 洗涤缓冲器放入每个井中。更换此卷三次。吸管100µL 生物素化检测抗体 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化2小时的 RT。 去除抗体和吸管400µL 洗涤缓冲器入每个井。更换此卷三次。添加100µL/井标记的链亲和素 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化20分钟的 RT (检查制造商的指示)。 将链亲和素和吸管400µL 洗涤缓冲器放入每个井中。更换此卷三次。 添加100µL 的基体 (制造商推荐) 和孵化20分钟在黑暗中 (检查制造商的指示)。注意: 此步骤是光敏的。避免对承印物和板材进行轻曝光。 通过添加50µL 停止解决方案 (1 M H2, 所以4) 停止反应。用微板块读取器测量每个井在 450 nm (参考: 570 nm) 的吸收。减去吸收在570毫微米从450毫微米。注: 未经治疗和/或车辆组织控制作为阴性控制。为了诱发肺组织的免疫应答, 应使用适当的刺激 (例如, 100 的脂多糖 (LPS)) 作为阳性对照。在培养基中培养两个 PLCS 的两个井, 以100的脂多糖 (例如, 24 小时), 收集上清和组织裂解液, 如步骤9.3 所述。注: 如果最高标准的吸收量等于或高于 1.0, 则接受实测结果;否则, 测量需要重复。标准曲线应遵循 sigmoidal 剂量-响应曲线拟合。 在步骤9.11 中, ELISA 测定的细胞因子浓度 (pg) 归一化成每样组织裂解物中测定的总蛋白质含量 (见10节)。 10. 人体 PCLS 中总蛋白含量的测定 注意: PCLS 需要裂解来测量总的蛋白质浓度。步骤9.3 中的组织裂解物用于此步骤。该检测是在一个扁平的96井板与25µL/井的组织裂解, pipetted 重复。 准备一个7点 bsa 标准, bsa 浓度为2000µg/毫升, 1500 µg/毫升, 1000 µg/毫升, 750 µg/毫升, 500 µg/毫升, 250 µg/毫升, 125 µg/毫升。对每个标准应用25µL, 并在96井板上使用25µL 缓冲液作为空白 (使用板盖板)。 吸管25µL 的裂解物 (参见步骤 9.3) 从每个井在重复入96井板材。总共需要50µL 的井。通过稀释1:50 中的能比试剂 a 的方法, 制备出工作试剂。对于96井板使用400µL 试剂 B 和2万µL 试剂 a。 仔细吸管200µL 的工作试剂, 以避免气泡。三十年代将盘子放在轨道振动筛 (150 rpm) 上, 以确保裂解物和工作试剂的适当混合, 并在盘子上盖上一板。在黑暗中孵化37摄氏度的盘子30分钟。使用微板块读取器测量每个井在 540-590 nm 上的吸收量。注: 如果吸收最高的 BSA 标准等于或高于 0.8, 则接受测量结果;否则, 测量需要重复。标准曲线应遵循 sigmoidal 剂量-响应曲线拟合。 为了进行分析, 用4参数马夸特方程计算了空白后的标准曲线。使用标准曲线拟合计算未知样品的蛋白质浓度。