細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

人間の PCL の実験を世界医師会の倫理コードに従って実行し、(ここに示す模範的な PCL 実験は、ハノーファーの倫理委員会で承認されたローカル倫理委員会の承認する必要医学部;番号 2701-2015)。ひと肺材料の使用する書面によるインフォームド コンセントは、すべてのドナー患者やその近親者から必要です。本稿に記載されている結果は、肺癌患者から受けた組織のほとんどがあった年齢別、性別、病歴と切除の原因のドナーから切片が得られました。のみ無料の腫瘍組織は、実験に使用されました。 1. 一般人間 PCL やそれに続く化学物質曝露の準備 注: 2 人は、肺を埋める必要があります。A 型肝炎と B の最新の予防接種記録をお勧めします。患者は c 型肝炎と HIV の肺移植の前に定期的に上映されます。結核菌とアクティブな感染を診断された、あるいは疑われた場合肺を拒否する必要があります。それにもかかわらず、すべての新鮮なひと肺組織とそれから派生したサンプルとして扱われなければならない潜在的感染症及び対応する保護対策が必要 (粒子フィルター マスク (FFP2)、保護メガネ、手袋) の労働安全を確保するため、スタッフ。60-90 分を要します。 人間の肺の葉の厳守を確認します。注: 胸膜に涙は、組織の均一な充填を防ぎます。ひと肺材料は、切除の日からする必要があります。アガロース氷の上でそれを充填する前に室温 (RT) で約 2 時間の記憶期間が許されます。このプロトコルで使用する組織は、切除を受けた患者から取得されます。死亡例からはありません。組織は、氷の上に格納されている場合、それを充填する前に RT に暖かい事前 agarose がすぐに重合するそれ以外の場合、均一な充填はできません。注意: は、白衣、手袋、キャップ、マスクの 2 つのペアと安全メガネのペアから成る防護服にネイティブのひと由来の材料との接触のすべての人を置くことを確認します。ひと由来の材料は、感染の危険性です。 低ゲルの agarose の 7.5 グラムの重量を量るし、bi 蒸留水 250 mL を加えます。Agarose を溶けるまで電子レンジでアガロースを沸騰させます。Agarose の溶融とゲル化点によって、およその 40 ° C に冷やしてください。注: いくつかのフラスコが必要、葉のサイズに応じて。 事前にウォーム アップし、37 ° C で培 (材料表)注: agarose が熱すぎる培養液中のビタミンが有効性を失われ、細胞が破損しています。媒体/アガロース溶液の温度は、37 ° C 以下が、ゲル化のプロセスは開始し、肺の均一な充填を損ないます。37 の ° C から 39 ° C の温度範囲のみをお勧めします。 範囲内で開始する前に必要なすべての材料を配置: 5-10 クランプ、約 1 m の長さ、(例えば、50 mL の) 適切な注射器の柔軟なカテーテル、カテーテルや氷を入れたアイス ボックスへの接続をフィッティングします。 シリコン チューブを挿入することで気管・主気管支を cannulate し、クランプの組織圧搾一緒にシリコン チューブと一緒にオフつまんなくチューブに平行を指向にクランプしています。シリコン チューブ内執着、充填処理中に抜け出すことができないことを確認します。クランプと他のすべての気管支、血管と傷害を閉じて、充填処理中に漏るしているアガロースことができません。 ビーカーに培と 3% 低ゲルの agarose の相当量を混ぜます。50 mL の注射器を使用して肺に混合物を植え付けます。培地で注射器を補充する前に、クランプは、指や気泡、アガロースの逆流を避けるためにクランプでカテーテルをシャット ダウンします。それは十分に膨脹させたまで肺葉, 肺区域を記入します。慎重に触れる側の肺胸膜胸膜は、でも、ハードにする必要があります。注: 肺葉, 肺区域のサイズによってアガロース/メディア ソリューションの 2 または 3 L までが必要になります。 単一の標本内のいくつかの気管支の場合各気管支の 1.5 1.6 の手順を繰り返します。 植え付け agarose の量に応じて、20-40 分のゲルに agarose の重合のための氷に肺を置きます。ハードやクール、その重合が完了を示すかどうかを確認、それ以外の場合は、待ちますいくつか両側胸膜を慎重にタッチします。病理が肺のスライスを切り、それらのサンプルを取るし、輸送のため氷の上肺材料を格納できるようにします。 ひと肺組織を 3-5 cm のスラブに鋭いナイフでカットします。注: は、シャープネスを確保するためすべての肺の新しいブレードを使用します。 400 mL の冷たいアールの平衡塩溶液 (EBSS) で組織スライサーを埋めます。すぐに最寄りの直径のコアリング ツールを使って半自動ドライバーを使用して肺のスラブからの円筒形のティッシュのコアをカット (例えば、8 mm; 10 mm)。注: この直径はマシンの内部ティッシュ ホルダーの直径に相当する必要があります。 所望の厚さ値に肺のスライスの厚さを調整します。注: 約 250 μ m の厚さは、PCL の実験では使用されます。組織スライサーのメーカーでは、スライス厚の検証のための組織スライスの厚さゲージをお勧めします。また、全取り付ける染色共焦点顕微鏡と組み合わせて Brismarらによって説明するように、スライス厚を決定する使用できます。27 組織スライサーのティッシュ ホルダーにティッシュのコアを転送します。組織のコアの上に重量 (ティッシュ ホルダーの一部) を置きます。組織スライサーの腕の速度と刃の速度を 6 に設定します。組織のコアを PCL にスライスを開始します。 500 mL の市販ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) の補足: 栄養混合物 F-12 DMEM/F12 (1:1) (10,000 単位/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (10,000 μ g/mL) 5 ml。冷蔵庫に生殖不能の条件の下で数日間培養培地を保存します。あらかじめ媒体の必要量のみを温めます。注: ペニシリンは 37 ° C で長期間保管した場合不活性化します。血清組成変化バッチからフェノール赤などの色素は、アッセイに干渉できる血清、色素フリーの培養培地を使用します。 25 mL 冷たい培養培地のシャーレ (100 × 15 mm) を入力します。媒体は、ガラス シリンダーのクランプを開いて、ビーカーに組織スライサー外に排水する必要があります。アプリケータ (例えば、接種ループ) を使用して、スライスをビーカーから培地をシャーレに転送します。インキュベーター (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) にペトリ皿を置きます。洗浄の手順を実行する前にウォーム アップ的に許可します。注: すべてそれ以上の手順は、無菌条件下で実行されます。 シャーレ、PCL を洗浄するためにセル ストレーナーを配置します。完全にセル ストレーナーを 10 mL の血清ピペットで培を削除し、37 ° C に予め温めておいた新鮮な媒体の 25 mL を追加します。このステップは、3 – 4 回 30 分毎を繰り返します。注: セルのストレーナーは、スライスへの損傷を避けるために、ピペットに吸い込まれてからスライスを防ぎます。 ウェルあたり 2 つのスライスを 500 μ L の培地の最低 24 ウェル培養プレートに肺のスライスを慎重に転送します。物質 (3.1 3.4 の手順を参照してください)、肺組織を公開など、37 ° C、5% CO2で 24 時間。注: 転送のため、接種ループを使用して、組織の損傷を防ぐためにループにスライスのフロートを聞かせて好ましく。十分な新鮮な媒体の不足だけは切片の細胞死を誘導すると、スライスのさらに分離する必要はありません。スライスすることができます重複または井戸に互いに接触: 組織の生存率に影響を与えません。 少なくとも 24 時間の定着剤 (例えば10% ホルムアルデヒド) とプラスチック フラスコにすべて残留ひと由来の材料を入れ、処分プロセスでこれを焼きます。注意: ホルムアルデヒドは有毒である、フードの下でこの手順を実行します。 2 PCL の組織学的解析 2 つのフォーム パッドを固定液に浸漬と生検カセットを準備 (e.g。、4% 緩衝ホルムアルデヒド)。生検カセットに泡パッドの間 PCL を置き、すぐに組織を固定液に転送します。修正 4% で一晩組織は、ホルムアルデヒドをバッファリングします。 キシレン (3 x 1 h) と標準的な病理組織学プロトコルに従って流動パラフィン (3 x 1 h) 洗濯後脱水エタノール (70%、90%、100%、100%、100%、100%)、各 1 時間のサンプルで埋め込むパラフィンの組織を処理します。 埋め込み型に、PCL を転送します。接種ループを使用します。流動パラフィンに PCL ティッシュを埋め込みます。パラフィン ブロックを鋳造金型で組織を均等に配置することを確認します。 フラットとも面まで回転式ミクロトームで、PCL を含む組織ブロックをカットします。所望の厚さの切片を取る (e.g。、4 μ m)、全体の PCL までそれらを個別に連続した番号でコーティングされたガラス スライド (通常 25-30 節を取ることができる) を配置することが行われました。 オリエンテーションのためのヘマトキシリンとエオシン染色 (H & E) と単一のガラス スライド (すべての 8-10 のセクション) を染色します。(最初と最後の 8 セクションは通常完全な) 方向スライドに基づいて実験のためのセクションを選択します。注: (省略可能) 保存用液体パラフィンで長期貯蔵までスライドを浸すことができます。 3. 物質の溶液の調製 注: 作業ソリューションと使用直前にコントロールを準備します。 注意: 安全上の注意に従って物質を処理または潜在的に有害、不明な場合、日常的な安全上の注意に従ってください。 直接培地の水溶性物質を溶解します。不溶または難溶性の化学物質、物質溶解度に応じて適切な溶剤で物質を溶解する最初。限られた水容解性の物質 (< 0.1 mg/mL) DMSO やエタノールで、たとえば、解散することができます。非毒性溶剤濃度あらかじめ滴定法により決定してください。解決中に希釈されたときから沈殿しない物質であることを確認します。注: HClPt/ナトリウム ・ ラウレス硫酸塩 (SLS) ソリューションを用意しています。 物質で原液を 100 倍準備培養液や溶剤で必要な最高濃度の。12.5 mg HClPt と 34.4 mg SLS を比較検討し、培地 1 mL 中の化学物質を溶解することにより原液を準備します。注: これらの化学物質に必要な溶剤はありません。 予め温めておいた培地で 1: 100 の最終希釈を準備します。溶媒を以前に使用した場合このアプローチはすべての物質濃度の同じ最終的な溶媒濃度の結果します。 PCL の標準治療の最終的な溶媒の濃度 (例えば3.3 の手順に記載されている 1%) を使用します。[結果] セクションに記載されている化学物質に必要な溶剤コントロールがありませんでした。 4 細胞毒性の試金のための正と負の参照 すべての実行可能性の試金のためには、次の次の正と負のコントロールを準備します。 組織制御: 細胞培養条件 (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) で 24 時間の未処理の PCL の参照としてのみ培地の PCL をインキュベートします。 車両の制御 (必要に応じて): PCL の参照のみの車両として最終的な溶媒濃度と PCL を孵化させなさい (手順 3.4 参照) 培養条件 (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) で 24 時間。 肯定的な制御: 4 ° C で 1 時間の緩衝液 1% 洗剤と PCL を孵化注: PCL は無色になると、組織は死んでいます。合計 L-乳酸脱水素酵素 (LDH) は、約 1.9 2.3 (手順 6.1 6.4 参照) の吸収で、上清に決定されます。組織は WST 1 アッセイ用 (5.1 5.5 のステップを参照)、約 0 の吸収。 5. WST-1 によって人間の PCL で化学的に誘発細胞毒性の測定 注: WST 1 アッセイは、ウェルあたり 2 つの PCL と 24 ウェル プレートで実行されます。好ましくは、パラメーターごとに重複を使用し、測定後これらの重複の結果をプールします。 開始する前にすぐに媒体の WST 1 試薬を希釈して、実用的なソリューションを準備します。実用的なソリューションの必要量は、24 ウェル プレートの 250 μ L/ウェルです。したがって、1 つの井戸の培地の 225 μ L で試薬を 25 μ l 添加をミックスします。 1.16 のステップから PCL のインキュベーション後破棄またはサイトカイン測定や LDH の測定等の試験に上澄みを使用します。残りの組織は、次の手順で使用されます。 ピペット 250 μ L あたり WST 1 試薬濃度作業のもし、1 h.、PCL が潜伏中に完全に WST 1 試薬に記載されて確認のため CO2を 37 ° C、5% でプレートを孵化させなさい。 軌道シェーカー (200 rpm) でプレートを置き、30 のため慎重に振る s WST 1 試薬の混合を徹底したことを確認します。24 ウェル プレートの各ウェルの上澄みから重複に新しいフラット底 96 ウェル プレートとピペット 100 μ L を取る。 450 各ウェルの吸光度 nm (参照: 630 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。630 で吸収を引く 450 から nm nm。これらの値使用されます手順 5.6 で計算)。注: 細胞毒性評価のための信頼性の高いデータは、実行可能な組織からのみ取得できます。したがって、ヘスらによって公開されたこれらの承認基準15は、各実験で満たす必要があります。これらの条件が満たされていない場合は、実験を繰り返す必要があります。 対照媒体の吸収は、0.6、そうでなければ実験を繰り返す必要があります上する必要があります。場合は、データは、この要件を満たすため、組織制御の吸収値を 100% に設定し、組織制御に関連して扱われたサンプルの WST 1 削減を計算します。 6. LDH アッセイ 注: LDH アッセイは、後の潜伏期間の後 100 μ L 培養合計で上清中の 96 ウェル プレートで実行されます。 テスト エージェントの有無に PCL のインキュベーション後、ステップ 1.16 から上澄みの 50 μ L を取るし、新しい 96 ウェル プレートに重複転送。これは各 24 ウェル プレートの処理から重複を生成します。 LDH 試薬、アッセイ直前の作業ソリューションを準備します。触媒溶液 (1 mL bidistilled 水に溶解した lyophilisate) 成っている、実用的なソリューションとソリューションの製造元によって提供を染料します。1 つの 96 ウェル プレート、色素溶液の ml の 6.25 触媒溶液の 125 μ L を徹底的に混ぜます。注意: 直接光にソリューションが公開されません。 ピペット 50 μ L 各作業ソリューションの清既に含む 50 μ L をよく、暗闇の中で常温に 20 分間プレートを孵化させなさい。さらに混合することが必要です。 492 で各ウェルの吸光度 nm (参照: 630 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。630 で吸収を引く 492 から nm nm。これらの値は、6.5 のステップの計算に使用されます。注: 細胞毒性評価のための信頼性の高いデータは、実行可能な組織からのみ取得できます。洗剤処理コントロールの吸収は 1 以上にする必要があります。 分析手順を 100 %4.1 から肯定的な制御の吸収値を設定し、(すなわち、最大 LDH リリース) 肯定的な制御に関連して扱われたサンプルで LDH リリースを計算します。 7 共焦点レーザー走査顕微鏡 (cLSM) で微細な生存率分析 注: 顕微鏡実行可能性の試金のため通常 250 μ m 厚 PCL の 2 つは 24 ウェル プレートの 250 μ L/ウェルで黒ずんでいます。各スライスは個別に撮影された、さらに重複する必要はありません。 テスト項目の有無と PCL のインキュベーション後、上澄みを廃棄またはサイトカイン測定または LDH の測定等の試験に使用します。ここで説明されている手順の残りのティッシュを使用します。 作業のカルセイン AM とエチジウム ホモ 1 (EthD-1) による希釈培地の 4 μ M の両方の試薬濃度作業を準備します。この目的のため 997 μ L の培養液に 1 μ L カルセイン AM (4 mM) のと EthD-1 (2 mM) の 2 μ L を追加します。このボリュームは、2 つの PCL 4 井戸を染色する必要があります。注: は、直接光に試薬の暴露を避けます。 ピペット 250 μ L 各作業希釈のよく、暗闇の中で RT の 45 分の 24 ウェル プレートを孵化させなさい。150 rpm で軌道シェーカーに染色液をティッシュのより良い露出を確保するため潜伏中にプレートを配置します。 45 分後に染色液を捨て、暗闇の中で RT で 3-5 分間 150 rpm で握手をして緩衝液を 1 mL と PCL を洗います。この手順を 2 回繰り返します。 培地からの蛍光を避けるためにステンド グラスの PCL を含む各ウェルに緩衝液 500 μ L を適用します。微視的評価内生体との少なくとも 2 つのランダムに分散 z スタックを実行します。 X/0.3 10 を選択する眼のタブをクリックして目的と PCL の表面を見つけるための標準的な光学顕微鏡と cLSM を使用するオンラインをクリックします。眼の設定を終了するオフラインをクリックします。 [取得] タブをクリックし、蛍光物質の適切なレーザー入れます。注意: 波長 488 のアルゴン レーザーを使用ポリアニオン性色素カルセインの nm (495 の励起波長 nm)、HeNe レーザー波長 543 nm EthD-1/DNA 複合体の検出 (533 の励起波長 nm)。アルゴン レーザーは、これはレーザー寿命大幅延長と一般的に約 5.7 A、管電流を有効にする最大電流の 30-50% で実行ください。 光パスの [取得] タブをクリックして、必要なフィルターおよび実験のためのミラーを設定します。注: 本研究ではメインの二色性ビームスプリッターで使用されたフィルター ベースのシステム (例えば.、HFT 488/543) 励起と放射光を分離します。この光はさらに二次二色性ビームスプリッター (例えば、NFT 545) に送られます反射ミラーを介して別光から出力サンプル 2 つのチャネル。 バンド設定を渡すフィルター (例えば、BP 505 530 カルセイン信号と EthD-1/DNA の複雑な信号の BP 560-615) 波長の特定の範囲のみを送信、3 チャンネルにチャンネル 2 にカルセイン信号と EthD-1/DNA の複雑な信号を割り当てます。 Z スタックをオンにすると、微細なボリュームの上限と下限の制限を設定するします。画面上の対応するレイヤーのライブ表示するライブのボタンを押します。検索鋭い信号と PCL の表面の上下にフォーカスを移動します。 チャンネル サブセクションをクリックし、チェック ボックスすべてを表示します。ライブ画像の下に対応するチャンネルのボタンを押すことによってテーブルをロックし、チャネル色をアクティブにします。注: ライブ イメージのブルーの色は、白で高信号が表示され、露出オーバーの信号は赤で表示されます一方、信号は無いが表示されます。 ライトのコレクションの効率性と光学セクショニングの最善のトレードオフの 1 風通しの良いユニットに赤の EthD 1 チャンネルにピンホールを設定し、カルセイン チャンネルを調整します。白がアクティブ チャネル カラー ロックアップ テーブルをライブ画像で赤くないような利得の検出信号を増やします。注: マスターの利得は 600 台を超えない。 活性化チャネル カラー ロックアップ テーブルをライブ イメージに青色で表示されるように背景を調整するデジタル オフセットを増減させます。 多次元取得に Z スタック タブをクリックし、フォーカスを使用して、z 興味を持つ層にシフトします。最初の設定以降の獲得のためのこの位置を保存するキーを押します。ゆっくりとフォーカスを上下に 30 μ m の範囲に達しているし、最後の設定を保存するを押してまで。 ライブ画像を非アクティブ化し起動実験にイメージングを開始するキーを押しますもう一度Liveをクリックします。注: 実行可能な組織はポリアニオン性色素カルセインの蛍光性検出されます。死んだ細胞は、EthD 1 と核酸の複合体の形成によって差別されます。 8. 画像のレンダリング 注: イメージ レンダリング ソフトウェアの勧告は、コンピューターする必要があります考慮する、ようにこのプログラムは、適切なハードウェアを必要とします。 顕微鏡による生存率は、画像レンダリング ソフトウェアに PCL (セクション 7 を参照) の染色から取得した LSM ファイルを読み込みます。進む前に .ims ファイルとしてそれを保存します。組織制御に関するすべてのパラメーターを設定し、これらのすべてのイメージに適用。それ以降の変更は許可されません。 (カルセイン染色) 実行可能なティッシュの表面再構成のための音量ボタンを使用 (補足図 1 a)、死んだ細胞核 (補足図 1 H) スポット ボタン。1 つのチャネルをレンダリングするときのスイッチ表示調整ウィンドウ内の他のチャネルを切る。 重要な組織のボリュームをレンダリングすることによって開始: 表面のチャネルを設定、全体の画像を処理する、滑らかな係数を 0.5 μ m に設定およびしきい値 (補足図 1 b C) の絶対強度を使用します。青い右矢印を押します。 再建されたボリュームの絶対強度のしきい値を調整します。ノイズやバック グラウンド強度を減算する必要があります。表面オーバーレイはグレーで表示され、表面被覆率の精度にする必要があります (図 1 の補足) をチェックします。調整が終わったら、青い右矢印を押します。ほとんどの場合この手順は、設定の計算に必要なです。ソフトウェアは、ボリュームを計算することは場合、は、滑らかな率を増加させます。 最後の手順でフィルターを選択します。(補足図 1E) 肺胞腔内マクロファージを除外するサーフェス レンダリングのため (約 10 μ m) で真球度フィルターを使用します。緑の [進む] ボタンを押します。 光学出力画像を調整し、.xls ファイルとして統計情報をエクスポートします。容量 (合計) は、詳細な分析 (補足図 1 f G) 使用されます。設定を保存し、同じ cLSM 設定 (補足図 1I) で同じ日に撮影した z スタックのすべてのさらなる解析のために使用します。 死んだ細胞核の赤のチャンネル (スポット) を再構築します。ランダムに μ m サーパス ウィンドウのスケーリングのドットのサイズを測定します。ドットサイズです約 5 μ m マークを有効にしてドットのサイズを設定します。各ドットが一度だけカウントされますすべてのドットがマークされているかどうかを確認します。(補足図 1 b H、J) が必要な場合は手動で修正します。青い右矢印を押します。 プレス プログラム パラメーターに従ってスポットの合計数を計算する/カウントさせる緑色の前方ボタン設定し、.xls ファイル (補足図 1 K, L, M) として、結果をエクスポートします。イメージのグラフィカルな統計分析のために重要な組織のボリューム比率で計算される死んだ細胞の核の数を設定します。 9. 人間 PCL におけるサイトカインとケモカインの測定 注: サイトカイン ・ ケモカインの免疫応答で測定可能と細胞外培養上清中細胞内組織溶解液の培養時間後。ELISA は、100 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートでの重複で測定されます。 緩衝液の 495 ml 洗剤 5 mL を混ぜて 1% 中性洗剤溶液を準備します。ソリューションは、数ヶ月間常温保存できます。 プロテアーゼ阻害薬 (PI) レバレッジの比率で 1% 中性洗剤溶液を混ぜます。必要量によって異なります培養プレート;たとえば、24 ウェル プレートに 500 μ L/ウェルを使用します。よく、洗剤溶液の 499 μ L で円周率の 1 μ L を混在させます。 PI 溶液 1 μ L でのチューブを用意し、500 μ L の培養上清中にこれらの管を収集します。すぐに 9.2 の手順の準備として、PI を含む 500 μ L 洗剤によって 24 ウェル プレートで媒体を交換します。4 ° C で 24 ウェル プレートを配置することによって、1 h のための組織を溶解させます。組織ライセート新しい管にピペットで移しなさいとさらに詳しい分析まで-80 ° C でこれらのチューブを格納します。注: ELISA のプロトコルは高いメーカーに依存し、製造元の指示に従う必要があります。標準的な ELISA のプロトコルは、次の説明です。 培養上清または製造元の指示に従ってライセート中サイトカイン濃度を測定する elisa 法を実行します。Il-1 や TNF-α を測定する (の希釈は、製造元の指示に従って) キャプチャ抗体の 100 μ L 分注により a96 ウェル プレート、コーティングした一晩インキュベートし、 Bidistilled 水 1 L に洗浄バッファー タブレットを溶解して洗浄バッファーを準備します。各ウェルに捕獲抗体とピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。ブロッキング剤 (例えば製造元の指示に従って、緩衝液 1 %bsa) を追加することにより、プレートをブロックします。1 時間室温で孵化させなさい。注: 標準的な市販 Elisa が組織培養上清またはライセートの 2 x 100 μ L 必要です。サンプルは、一度解凍し使用する前にする必要があります。リリースされたサイトカインのアッセイの感度に応じて測定前サンプルを希釈する必要があります。したがって、アッセイによって提供される試薬のサンプルを希釈します。 ブロッキング液を削除し、(希釈は、製造元の指示に従って) の標準曲線の希釈サンプルを追加および組織培養上清中の 100 μ L または組織ライセート ステップ 9.3 で収集した重複の 100 μ L。室温 2 時間インキュベートします。 各ウェルにサンプルやピペットで移しなさい 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。ピペット 100 μ L のビオチン標識検出の抗体 (の希釈は、製造元の指示に従って)、室温 2 時間インキュベート 各ウェルに抗体とピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。(希釈は、製造元の指示に従って) 100 μ L/ウェル HRP 標識ストレプトアビジンを追加し、室温で 20 分間インキュベート (製造元の指示を確認してください)。 各ウェルにストレプトアビジンとピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。 (メーカーによって推奨) 基板の 100 μ L を追加し、暗闇の中で 20 分間インキュベート (製造元の指示を確認してください)。注: この手順は、光に敏感なです。基板とプレートの光の露出を避けてください。 50 μ L ストップ ソリューションの追加によって反作用を停止 (1 M H2SO4)。450 各ウェルの吸光度 nm (参照: 570 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。570 で吸収を引く 450 から nm nm。注: 未処理や車両組織コントロールがネガティブ コントロールとして提供します。肺組織の免疫応答を誘導する、陽性対照として適切な刺激 (例えば、100 ng/mL リポ多糖 (LPS)) を使用します。など、24 時間培養液で 100 ng/mL lps ウェルあたり 2 つの PLC と 2 つの井戸をインキュベートし、上澄みと組織ライセート 9.3 の手順で説明するようを収集します。注: 測定結果を受け入れたが、最高水準の吸収が 1.0 以上の場合それ以外の場合、測定は繰り返される必要があります。標準的な曲線はシグモイド用量-反応曲線のあてはめを従う必要があります。 サイトカイン濃度 (pg) ステップ 9.11 で elisa 法による決定が組織ライセートの各サンプルで決定総たんぱくに正規化された (セクション 10 を参照してください)。 10. 人間 PCL で総たんぱく量の測定 注: PCL は、総蛋白濃度を測定するために分離する必要があります。ステップ 9.3 から組織溶解液は、このステップに使用されます。アッセイは、重複戻組織ライセートの 25 μ L/ウェルの 96 ウェル フラット プレートで実行されます。 BSA 2,000 μ g/mL、1,500 μ g/mL、1,000 μ g/mL、750 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ G/ml、125 μ G/ml の濃度で 7 ポイント BSA の標準を準備します。各標準の重複で 25 μ L を適用し、96 ウェル プレート (プレート カバー プレート使用) の空白として 25 μ L 緩衝液を使用します。 ピペット 25 μ L の各ウェルの 96 ウェル プレートに重複から lysates (ステップ 9.3 を参照)。合計、それぞれを 50 μ l 添加も必要です。試薬 B 1:50 BCA 試薬 A. 希釈 BCA で BCA ソリューションの作業試薬の準備します。96 ウェル プレート使用試薬 B を 400 μ l 添加し、20,000 μ 試薬 a. 慎重にピペット 200 μ L 作業試薬を各ウェルに空気の泡を回避するのです。30 の軌道シェーカー (150 rpm) でプレートを置き lysates と作業試薬の適切な混合を確実にプレートにプレート カバー s。暗闇の中で 30 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。各ウェル マイクロ プレート リーダーを使用して 540-590 nm の吸収を測定します。注: 測定結果を受け入れたが、標準的な最高の BSA の吸収が 0.8; 以上の同じ場合それ以外の場合、測定は繰り返される必要があります。標準的な曲線はシグモイド用量-反応曲線のあてはめを従う必要があります。 分析のためダミーの減算後 4 パラメーター マルカート式による標準曲線を計算します。標準曲線を用いて未知試料の濃度を計算します。