Summary

Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

Published: January 16, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.

Abstract

O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.

Introduction

Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios3, peptídeos2 ,4, proteínas de2,5, metabólitos6,7, os N-glicanos8e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas9,10. O número de publicações, demonstrando a utilidade desta técnica tem crescido significativamente ao longo da última década,6,11,12,13. Certas moléculas, como lipídios, são relativamente fáceis de analisar através de MALDI MSI, como eles ionizam facilmente devido à sua natureza química e, portanto, requerem pouca preparação prévia3. No entanto, para alvos mais difíceis, como peptídeos, as etapas necessárias para ionizar eficazmente estas moléculas são extensos e complicados geralmente14. Atualmente, existem poucas publicações que visam endereço ou demonstram reprodutibilidade nas metodologias que são utilizadas para preparar o tecido para esta técnica visual original15. Por esta razão, nós temos compilado observações e implementado otimizações em um único, fácil de implementar, metodologia que não requer pouca ou nenhuma modificação, para a análise de peptídeos formol um reticulado tecido fonte14.

Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia reproduzível validada, de baixo custo para a detecção e mapeamento espacial de peptídeos, gerados a partir de congelados fixada em formol (FFF) e fixada em formol parafina (FFPE) cortes histologicos. Esta metodologia não exigem ou dependem de qualquer instrumentação especializada3. Especificamente, abordamos os muitos aspectos especializados da preparação da amostra necessário para analisar os peptídeos; etapas como antígeno recuperação16 e revestimento de matriz. Nosso protocolo também utiliza equipamento barato e reagentes, tornando esta metodologia acessível para uma comunidade mais alargada, que seria incapaz de pagar os aparelhos robóticos alternativo17.

O raciocínio por trás do desenvolvimento de um método de preparação de amostra manual foi dupla: em primeiro lugar, o uso de um Sublimador cria um revestimento consistente e homogêneo dos cristais de matriz que são ~ 1 µm no comprimento18, algo inatingível com pulverização mais comuns técnicas. Em segundo lugar, o conjunto relativamente pequeno de custos: o custo total do aparelho personalizado foi <$ 1500 AUD. Notamos que, em termos de custo-eficácia, o preço por exemplo é muito mais barato quando não há nenhuma maquinaria robótica envolvidos. O uso de sublimação foi relatado anteriormente, no entanto, para o melhor de nosso conhecimento, metodologias passo a passo que descrevem este processo e preparação da amostra não tem sido relatadas nem descritas na literatura.

Este protocolo destina-se a auxiliar os pesquisadores que têm acesso a um espectrômetro de massa MALDI e que têm a intenção de gerar informação espacial em relação a uma bio-molécula de interesse19. Em essência, MALDI MSI é uma forma de histológica de rastreio que não depende de anticorpos ou manchas2.

Protocol

Atenção: Todas as precauções de segurança devem ser seguidas quando efectuar este procedimento, incluindo a utilização de equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, aventais, luvas de nitrila, óculos de segurança, etc) 1. preparação de reagentes e equipamentos Preparação das soluções Para preparar 500 mL de fluido do Carnoy, misturar 100% de etanol (EtOH), clorofórmio e ácido acético em um 6: proporção de …

Representative Results

Se seguidas corretamente, este protocolo produz imagens que representam claramente a morfologia bruta do tecido sem nenhum arranhão ou outras deformações (Figura 1). A validação ideal para uma preparação de amostra realizada corretamente, é a capacidade de distinguir entre diferentes estruturas físicas, alterando a molécula sendo vistos (Figura 2). Um bom guia…

Discussion

Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação24; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de reconhecer a Sydney Medical School Foundation e Fundação e Blues para o financiamento de parte deste trabalho através do seu programa de bolsa de doutorado para investigação da doença de Alzheimer e uma concessão de ARC descoberta (DP160102063), atribuído a PKW.

Materials

Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

References

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O’Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

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