Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli
Summary
Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.
Abstract
Biomolecules N-glukanlardir için bir ana bilgisayardan uyuşturucu ve lipidler bu teknik analiz eder bu yana matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kullanımı, kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme hızlı bir şekilde, genişledi. Çeşitli örnek hazırlama teknikleri mevcut olmasına rağmen peptidler doku korunmuş formaldehit üzerinden tespit bu tür kitle spektrometrik analizi için en zor sorunlardan biri kalır. Bu nedenle, biz oluşturulan ve ionizable peptidler en fazla alabilme örnek içinde yer alan uzamsal bilgileri korur sağlam bir metodoloji en iyi duruma getirilmiş. Biz de bu maliyet etkin ve basit bir şekilde elde etmek böylece otomatik araçları kullanarak bağlandığınızda oluşabilir potansiyel önyargı veya hazırlık hata ortadan kaldırarak nişan. Sonuçta bir tekrarlanabilir ve ucuz iletişim kuralıdır.
Introduction
Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme yirmi yılda1,2biomolecules de dahil olmak üzere bir dizi analiz, bir görüntü dayalı teknik olarak istihdam: lipidler3, peptidler2 ,4, proteinler2,5, metabolitleri6,7, N-glukanlardir8ve tedavi uyuşturucu9,10gibi sentetik moleküller. Bu teknik yardımcı programı gösteren yayınlar sayısı önemli ölçüde son on yılda6,11,12,13üzerinde büyüdü. Bazı moleküllerin, lipitler, onlar kolayca onların kimyasal yapısı nedeniyle iyonize ve böylece küçük önceden hazırlık3istemek yolu ile maldı MSI, analiz etmek nispeten kolaydır. Ancak, peptidler gibi daha zor hedefler için kapsamlı ve genellikle karmaşık14etkili bu moleküllerin iyonize için gereken adımlar vardır. Şu anda bu adrese amacı veya doku bu benzersiz görsel tekniği15için hazırlamak için istihdam edilmektedir metodolojileri tekrarlanabilirlik göstermek çok az yayın vardır. Bu nedenle, biz gözlemler derlenmiş ve en iyi duruma getirmeleri uygulanan tek bir, uygulanması kolay, küçük hiçbir değişiklik, peptidler bir formaldehit üzerinden analizi için gerekli metodoloji çapraz bağlı doku kaynak14.
Bu makale, algılama ve peptidler, formalin sabit dondurulmuş (FFF) ve parafin gömülü (FFPE) doku bölümleri formalin sabit üretilen kayma eşleştirme için doğrulanmış, düşük maliyetli tekrarlanabilir metodoloji anlatmıştık. Bu metodoloji gerektirmez veya üzerinde herhangi bir özel araçları3kullanmaz. Özellikle, özel numune hazırlama peptidler analiz etmek gerekli birçok yönlerini ele; adımları antijen alma16 ve matris kaplama gibi. Bizim iletişim kuralı da ucuz ekipmanları ve Kimyasalları, böylece bu metodoloji aksi takdirde diğer robot aparatı17göze mümkün olacaktır bir toplumun erişilebilir hale getirme kullanır.
Bir elle numune hazırlama yöntemi geliştirmek arkasındaki mantık iki kat: Öncelikle, bir Süblimatör kullanımı ~ 1 µm uzunluğu18, bir şey daha yaygın püskürtme ile ulaşılmaz olan matris kristalleri ile tutarlı ve homojen bir kaplama oluşturur teknikleri. İkinci olarak, maliyeti nispeten küçük kurmak: özel aparat toplam maliyeti oldu < 1500 $ AUD. Biz maliyet etkinliği açısından dahil hiçbir robot makine olduğunda örnek başına fiyat çok daha ucuz olduğunu unutmayın. Süblimasyon kullanımı daha önce ancak, en iyi bizim bildiğim için bu süreci tanımlamak ve hazırlık örnek adım adım metodolojileri değil rapor ne de literatürde açıklanan bildirilmiştir.
Bu iletişim kuralı bir maldı Kütle Spektrometre erişiminiz var demektir ve faiz19bir biyo-molekül ile ilgili olarak mekansal bilgi üreten niyet kimsin araştırmacılar yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Özünde, maldı MSI histolojik bu eleme bir çeşit antikor üzerinde dayanmaz veya2lekeleri var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol analitler delocalization ortadan kaldırılması sırasında üretimi ionizable moleküler türlerin en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. En önemli faktörler örnek sindirerek ya da süblimasyon24sonra recrystallizing matris, uygularken aynı geçersiz kılma kuralı kullanarak içerir; Yani, bu buharı, hatta bir birikimi matris veya aksi durumda, oluşturulan saklanır ve gereken. Rekristalizasyon ve sindirim, eşit altında örnek için solvent yıkama pipetting ba?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu iş onların doktora burs programı sayesinde Alzheimer hastalığı araştırma ve PKW için layık bir ark keşif hibe (DP160102063) parçası finansman için Sydney Tıp Okulu Vakfı ve Blues ve Vakfı kabul etmek istiyorum.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
