הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור אמין עבור הכנת פורמלין קבוע רקמות המיועדים ספקטרומטר מסה דימות מבוסס-סובלימציה.
Abstract
השימוש של לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון, ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI MSI) במהירות התרחב, מאז טכניקה זו מנתחת מארח של מולקולות של סמים ושומנים כדי N-glycans. למרות טכניקות שונות של הכנת המדגם קיימים, איתור פפטידים מפורמלדהיד לשימור רקמות נשאר אחד האתגרים הקשים ביותר עבור סוג זה של ניתוח spectrometric המוני. מסיבה זו, יש יצר ואנו ממוטב מתודולוגיה חזקה ששומרת המידע המרחבי הנכלל המדגם, תוך העלאת את המספר הגדול ביותר של פפטידים ionizable. יש גם כיוונו כדי להשיג זאת באופן חסכוני ופשוט, סילוק ובכך פוטנציאליים שגיאה הטיה או הכנה, אשר יכול להתרחש בעת שימוש אוטומטי מכשור. התוצאה הסופית הוא פרוטוקול זול הדירים.
Introduction
לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI MSI) כבר מועסקים כמו טכניקה התמונה לפי שני עשורים1,2, ניתוח מגוון של מולקולות כולל: ליפידים3, פפטידים2 ,4, חלבונים2,5,6,מטבוליטים7, N-glycans8ומולקולות סינתטי כגון תרופות טיפוליות9,10. מספר פרסומים הממחיש את התועלת של טכניקה זו גדלו באופן משמעותי מעל האחרון העשור6,11,12,13. מולקולות מסוימות, כגון שומנים, הם יחסית קלים לנתח באמצעות MALDI MSI, כפי שהם ionize בקלות בשל אופיו הכימי שלהם הם דורשים הכנה מוקדמת קטן3. עם זאת, עבור מטרות יותר קשה כמו פפטידים, השלבים הנדרשים כדי ביעילות ionize מולקולות אלה הם נרחב ומורכב בדרך כלל14. כיום יש מעט מאוד פרסומים שואפים כתובת או להדגים הפארמצבטית למתודולוגיות זה מועסקים להתכונן רקמה זו טכניקה חזותי ייחודי15. מסיבה זו, יש להדר תצפיות ואנו מיושמת אופטימיזציות יחיד, קל ליישום, המתודולוגיה שבה צריך לדרוש קטנטן ללא, לניתוח של פפטידים מפורמלדהיד קישורים צולבים רקמת המקור14.
כתב יד זה, תארנו מתודולוגיה לשחזור מאומתים, בעלות נמוכה עבור איתור ומיפוי המרחבי של פפטידים, שנוצר בין קפוא פורמלין-קבועה (FFF) פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) סעיפים רקמות. מתודולוגיה זו לא דורשים או להסתמך על כל מתמחה במכשור3. באופן ספציפי, אנו הכתובת על היבטים רבים של משאבות מיוחדות צורך לנתח פפטידים; פעולות אחזור אנטיגן16 ו ציפוי מטריקס. פרוטוקול שלנו מנצל גם ציוד זול, ריאגנטים, ובכך מתודולוגיה זו לנגישים קהילה רחבה יותר מי שאחרת לא יוכלו להרשות לעצמם מכשיר רובוטי חלופי17.
ההיגיון העומד מאחורי פיתוח שיטת הכנה ידנית מדגם היתה כפולה: ראשית, השימוש של המחליף יוצר ציפוי עקבית ואחידה של גבישים מטריקס כי הם ~ 1 מיקרומטר אורך18, שעצם משהו עם ריסוס נפוץ יותר טכניקות. שנית, הגדרת עלויות קטן יחסית: העלות הכוללת של המנגנון מותאם אישית היה < אוד 1500 דולר נציין, מבחינת יחס עלות-תועלת, שהמחיר לכל דגימה זול בהרבה כאשר יש מכונות רובוטית לא מעורב. השימוש של סובלימציה דווחה בעבר, עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, מתודולוגיות צעד אחר צעד אשר מתארות את התהליך הזה לטעום הכנה יש לא היה דיווח ולא המתוארים בספרות.
פרוטוקול זה נועד לסייע לחוקרים יש גישה ספקטרומטר מסה MALDI ומי נחוש הפקת המידע המרחבי ביחס ביו-המולקולה של עניין19. בעיקרו של דבר, MALDI MSI הוא צורה של היסטולוגית ההקרנה כי אין להסתמך על נוגדנים או כתמי2.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה תוכנן כדי למקסם את הדור של המין מולקולרית ionizable תוך צמצום delocalization של analytes. גורמי מפתח כרוכות בשימוש אותו העיקרון דריסת בשעת החלת מטריצה, עיכול המדגם, או recrystallizing לאחר סובלימציה24; . כלומר, זה הפקדת אפילו אדי, מטריקס או אחרת, צריך יצירה ותחזוקה. Pipetting ממס מנקי recrystallization ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר את סידני קרן בית הספר לרפואה, בלוז ואת קרן למימון חלק מעבודה זו דרך תוכנית מלגות דוקטורט שלהם עבור מחלת אלצהיימר ומחקר של גרנט גילוי ארק (DP160102063) הוענק למקוםטוב.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
