Summary

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

Abstract

Xeno ללא תנאים מוגדרים לחלוטין הם פרמטרים מרכזיים עבור הדור חזק לשחזור של הומוגני האדם המושרה גזע pluripotent (hiPS) תאים. תחזוקה של תאים hiPS על תאים מזין או מטריצות לא מוגדר רגישים הבדלים אצווה, זיהום פתוגני הסיכון של immunogenicity. ניצול המוגדר רקומביננטי האנושי laminin 521 (LN-521) מטריצה ​​בשילוב עם פורמטים ללא xeno ו מוגדרים התקשורת מפחית השתנות ומאפשר את הדור עקבי של תאים hiPS. וירוס סנדאי (SeV) הוא וקטור שאינו שילוב מערכת RNA, ובכך לעקוף את החששות הקשורים השפעה משבשת פוטנציאלית על שלמות הגנום שילוב וקטורים יכול להיות. יתר על כן, אלה וקטורים הוכיחו יעילות גבוהה יחסית תכנות מחדש של fibroblasts עורי. בנוסף, אנזימטית תא יחיד passaging של תאים מקלה אחזקה הומוגנית של תאים hiPS ללא ניסיון קודם משמעותי של גזע ceLl תרבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול זה נבדק בהרחבה ופיתח עם דגש על reproducibility וקלות השימוש, מתן דרך מעשית ויציבה כדי ליצור מוגדר ו xeno ללא תאים hips האדם מן fibroblasts.

Introduction

מאז הגזירה הראשונה של שורות תאים hiPS ידי טקהאשי et al. 1 , 2 , תאים hiPS סיפקו כלי שימושי עבור דוגמנות המחלה, גילוי סמים כחומר המקור להפקת טיפולי התא ברפואה רגנרטיבית 3 . תרבות hiPS התא כבר זמן רב תלוי תרבות שיתוף עם תאים מזין fibroblast 4 , 5 או על Matrigel 6 ו עם ניסוחים התקשורת המכיל בסרום שור עוברית (FBS). שינויי אצווה אל אצווה הם תוצאה נפוצה של הטבע הבלתי מוגדר של תנאי תרבות אלה, וכתוצאה מכך וריאציות בלתי צפויות, המהווה תורם מרכזי האמינות של פרוטוקולים אלה 7 . פיתוח של בינוני מוגדר כגון Essential 8 (E8) 8 ו מטריצות תרבות מוגדר תא למשל LN-521 9 , לאפשרS להקמת פרוטוקולים לשחזור מאוד וסיוע הדור החזקה ותחזוקה של תאים hiPS הומוגני 7 , 8 , 9 , 10 .

פיתוח של אינטגרציה חינם תכנות מחדש טכניקות כבר זינוק קדימה. במקור, תכנות מחדש היה תלוי על וקטורים retroviral אשר משולבים באופן אקראי לתוך הגנום עם השפעות משבשות על שלמות גנומית 11 . ההתקדמות במתודולוגיות של תכנות מחדש כוללת את הפיתוח של וקטורים מבוססי RNA. RNA וקטורים יש יתרון על פני שיטת ה- DNA מבוסס תכנות מחדש כמו אינטגרציה לא מכוונת באמצעות רקומבינציה גנומית אינו אפשרי 12 . SEV וקטורים לספק ביטוי גבוה וחולף של גורמים אקסוגניים באמצעות RNA יחיד תקועים ללא שלב ה- DNA 11 . את וקטורים תכנות מחדש שנמסר על ידי SEVהם מדולל ברחבי הרחבת התא ובסופו של דבר לשפוך מהתרבות לספק דרך הדפסה חופשית של תכנות מחדש. לאחר מכן, תחזוקה של pluripotency תלויה ביטוי אנדוגני של גנים pluripotency 2 .

כמו טיפולים חלופיים מבוססי תאים hiPS מתחילים לעבור ניסויים קליניים, הדרישות עבור אצווה סטנדרטית, reproducibility, ובטיחות הם נושאים חיוניים כדי לענות על 13 . לכן, מוצרים בעלי חיים יש להימנע. לדוגמה, השימוש במוצרים קסנוגניים קשור לסיכון לזיהום פתוגן לא אנושי. כמו כן, תאים מתורבת בנוכחות של בעלי חיים מרכיבים התרבות הנגזרים הוכחו לשלב חומצות siliac לא אנושיים לתוך קרום התא המאיים להבהיר תאים נגזרים immunogenic 14 . לפיכך, הצורך לחסל מוצרים xenogeneic הוא הכרחי על כל עיסוקים קליניים עתידיים. פרוטוקול זה חל על xeללא חופשי ומוגדר התרבות תחזוקה של תאים תאים hiPS נעים קרוב יותר תאימות קלינית.

פרוטוקול זה מתאר שיטה עקבית, לשחזור מאוד וקל לשימוש, שיוצר תאים hiPS סטנדרטי מ fibroblasts. הוא גם מציע מערכת ידידותית למשתמש תרבות עבור תחזוקה של תאים hiPS הוקמה. פרוטוקול זה שימש כדי להפיק יותר מ 300 שורות תאים hiPS ב שבדיה האדם הלאומי iPS מתקן הליבה בבית Institutet Karolinska אשר כמה שורות בעבר תוארו 15 , 16 .

Protocol

האוסף של חומר המטופל ו הגזירה של תאים hiPS מאושר על ידי מועצת המנהלים של סקירה אתית, שטוקהולם, 28 מרס 2012, מספר רישום: 2012 / 208-31 / 3. צעדים תרבות תאים צריך להתבצע בארונות biosafety אלא אם כן צוין אחרת. תמיד תרגול טכניקות טיפול סטרילית בעת עבודה עם תאים. אפשר מדיה, צלחות ריאגנטים להגי…

Representative Results

מ ביופסיה לתאי hiPS התהליך כולו מביופסיה לתאי hiPS הוקמה, ברור של וקטור תכנות מחדש מוכן לאפיון, לוקח בערך 16 שבועות ( איור 1 ). ציר זמן מפורט יותר מצוין באיור 2 א . כ 4 שבועו…

Discussion

התוצאה הצפויה של פרוטוקול זה הוא הדור המוצלח של מספר שורות תאים hiPS הנגזר clonally. חשוב לציין, השיטה לתחזוקה של הרחבת תאים hiPS הוקמה כאן המתואר הוא אמין יכול להתבצע עם ניסיון מוקדם מעט של תרבות תא גזע. אנזימטית תא יחיד passaging עם ROCKi יחד עם מטריקס LN-521 ידוע לשמור תאים כמו נורמלי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי SSF (B13-0074) וסוכני מימון של VINNOVA (2016-04134).

Materials

Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
PenicillinStreptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 ml tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 ml tube Eppendorf 0030123.301 1.5 ml tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 ml VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Play Video

Cite This Article
Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

View Video