Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Desde a primeira derivação das linhas celulares hiPS por Takahashi et al. ^{1 , 2} , as células HiPS forneceram uma ferramenta útil para modelagem de doenças, descoberta de drogas e como material de origem para a geração de terapias celulares em medicina regenerativa ³ . A cultura de células hiPS tem sido dependente da co-cultura com células alimentadoras de fibroblastos ^{4 , 5} ou em Matrigel ⁶ e com formulações de mídia contendo soro bovino fetal (FBS). As variações de lote para lote são uma conseqüência comum da natureza indefinida dessas condições de cultura, resultando em variações imprevisíveis, o que é um dos principais contribuintes para a falta de confiabilidade desses protocolos ⁷ . O desenvolvimento de um meio definido como Essential 8 (E8) ⁸ e matrizes de cultura de células definidas, por exemplo, LN-521 ⁹ , permitemS para o estabelecimento de protocolos altamente reprodutíveis e ajuda na geração e manutenção robustas de células hips homogêneas ^{7 , 8 , 9 , 10} .

O desenvolvimento de técnicas de reprogramação livre de integração tem sido um salto em frente. Originalmente, a reprogramação dependia de vetores retrovirais que se integrassem aleatoriamente ao genoma com efeitos disruptivos sobre a integridade genômica ¹¹ . Os avanços nas metodologias de reprogramação incluem o desenvolvimento de vetores baseados em ARN. Os vetores de ARN têm uma vantagem sobre o método de reprogramação baseado em DNA, uma vez que a integração não intencional através da recombinação genômica não é possível ¹² . Os vetores SeV fornecem expressão elevada e transitória de fatores exógenos através de ARN de cadeia simples sem uma fase ^de DNA ¹¹ . Os vetores de reprogramação entregues pela SeVSão diluídos durante a expansão celular e, eventualmente, derramam da cultura, fornecendo um modo de reprogramação livre de pé-impressão. Posteriormente, a manutenção da pluripotência é dependente da expressão endógena dos genes de pluripotência ² .

À medida que as terapias baseadas em células HiPS pioneiras estão começando a se mover para ensaios clínicos, as demandas de lotes, reprodutibilidade e segurança padronizados são questões essenciais para abordar ¹³ . Portanto, os produtos de origem animal devem ser evitados. Por exemplo, o uso de produtos xenogênicos tem sido associado ao risco de contaminação por agentes não humanos. Além disso, as células cultivadas na presença de componentes de cultura derivados de animais demonstraram incorporar ácidos siliac não humanos em membranas celulares que ameaçam tornar as células derivadas imunogênicas ¹⁴ . Portanto, a necessidade de eliminar produtos xenogênicos é necessária para qualquer atividade clínica futura. Este protocolo aplica xeCultura sem livre e definida na manutenção das células móveis do hiPS que se deslocam para as células mais próximas do cumprimento clínico.

Este protocolo descreve um método consistente, altamente reprodutível e fácil de usar, que gera células HiPS padronizadas a partir de fibroblastos. Ele também oferece um sistema de cultura fácil de usar para a manutenção de células HiPS estabelecidas. Este protocolo foi usado para derivar mais de 300 linhas celulares de hiPS na instalação nacional sueca de iPS Core em Karolinska Institutet, das quais algumas linhas já foram descritas ^{15 , 16} .