Summary

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Published: October 03, 2017
doi:

Summary

Saydam C. elegans bağırsak “sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası” olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

Abstract

Çok hücreli tüpler, tüm iç organları, temel birimleri polarize epitelyal veya endotel hücrelerinin apikal membranlar ile her diğer ve/veya hücre dışı matriks irtibata Lümen ve demiri membranlar astar oluşur. Nasıl bu farklı membran asimetrisi kurulan ve organ morfogenez sırasında tutulan hala bir çözümlenmemiş hücre biyolojisi meselesi. Bu iletişim kuralı sırasında apikal membran ve Lümen Biyogenez vurgu ile tüp morfogenez polarize membran dipnotlar analiz için bir model olarak C. elegans bağırsak açıklar. C. elegans yirmi-hücre tek katmanlı bağırsak epitel bir tek hücre düzeyinde çözümleme izin basit bir bilateral simetrik tüp içine yerleştirilmiştir. Membran polarizasyon kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş sırasında erken embriyogenez ama polarize de novo hücreleri artık çoğalırlar ve hareket membran Biyogenez larva büyüme devam eder oluşur. İkinci ayarı bir aynı anda farklı bu polarize süreçleri, çoğu polarite modellerinde ayırt etmek zor aracılık hücre altı değişiklikleri ayırmak izin verir. Apikal-, demiri membran-, bileske-, hücre iskeleti- ve endomembrane bileşenleri etiketli ve geliştirme GFP füzyon proteinler tarafından izlenen veya in situ antikor boyama tarafından değerlendirildi. Organizmanın genetik çok yönlülüğü ile birlikte, C. elegans bağırsak böylece benzersiz vivo içinde modeli için görsel, gelişimsel ve polarize membran ve tüp Biyogenez moleküler genetik analizi sağlar. Belirli yöntemler (tüm standart) burada açıklanan nasıl yapılır: bağırsak hücre altı bileşenleri etiket antikor boyama tarafından; genler polarize membran dipnotlar içinde yer alan işlev kaybı çalışmalar genellikle temel tubulogenesis genler için adapte tarafından analiz; farklı gelişim dönemleri sırasında polarite kusurları değerlendirmek; epifluorescence, fark girişim kontrast (DIC) ve confocal mikroskobu fenotipleri yorumlamak; görsel kusurları ölçmek. Bu iletişim kuralı epitel polarite, membran dipnotlar, tüp ve Lümen morfogenez herhangi ilgili kez son derece korunmuş moleküllerin analiz etmek için adapte edilebilir.

Introduction

Polarize membran etki alanları, oluşumu gibi hücresel ve hücre altı asimetriler nesil morfogenez ve hücre, doku ve organların1fonksiyonu için önemlidir. Hücre altı bileşenleri tahsisi yön değişiklikleri olan birden çok ardışık ve çakışık ekstraselüler ve hücre içi sinyalleri bağlıdır beri epiteli polarize membran Biyogenez üzerinde çalışmalar teknik bir sorun kalır zor çoğu modellerinde ayrı ve güçlü modeli sistemine bağlıdır. Tek katmanlı model burada – sunulan Caenorhabditis elegans bağırsak – zarif sadeliği bir doku olduğunu. Tek hücreli ile birlikte C. elegans boşaltım kanalı (bkz: kağıt polarize membran Biyogenez C. elegans boşaltım kanalı içinde eşlik)2, kimlik için birkaç benzersiz avantajlar sağlar ve molekülleri polarize membran dipnotlar için gerekli karakterizasyonu. Maya moleküler polarite ipuçları adama koruma yapmak bu basit omurgasız organ mükemmel bir“in vivo doku odası” hala çok şey insan sistemine doğrudan konu ile ilgili olan epitel polarite ilgili soruları için karmaşık görsel diseksiyon bu olayların tek izin düzeyi içinde vivohücre.

Birden çok korunmuş polarite İpuçları (1 extracelluar matris, (2) plazma zarı ve kavşak ve (3) hücre içi veziküler kaçakçılığı saptanan3, kendi entegrasyon süreci temel ilkeleri olmasına rağmen polarize epitelyal membran ve doku Biyogenez kötü anlaşılan4‘ tür. Klasik tek hücreli vivo içinde modelleri (e.g.S. cerevisiae ve C. elegans zigot), polarize hücre bölünmesi ve ön-arka polarite tanımlama vesile olmuştur ve kritik belirledik membran ilişkili polarite belirleyicileri (küçük GTPases/CDC-42, bölümleme arızalı PARs)5,6, ama onlar İpuçları (bud yara, sperm giriş) breaking eşsiz simetri bağlıdır ve kavşak güvenli eksikliği apicobasal membran etki alanları ve muhtemelen, makine sıralama karşılık gelen hücre içi apicobasal. Şu anki bilgilerimize polarize epiteli, kaçakçılığı organizasyonu hakkında ancak, öncelikle memeli 2D monocultures7, hangi membran konumlarını değiştirebilirsiniz fizyolojik ekstraselüler ve gelişimsel cues eksikliği dayanır etki alanları ve kaçakçılığı yörüngeleri yönleri (MDCK (Madin-Darby köpek böbrek) hücrelerde membran Polarite ters çevirmek için bir geçiş 2D 3D vitro kültür sistemleri tek başına yeterlidir)8. İn vivo gelişim çalışmaları epitel polarite omurgasız canlılar üzerinde başlangıçta düz epiteli, Drosophila melanogaster epidermis nerede kritik katkı tespit örneğin yapılmıştır birleşme dinamikleri polarize hücre göç ve hücre levha hareketi9için ve endositik için polarite bakım10ticareti. 3D vitro ve in vivo analizi Lümen morfogenez borulu epiteli MDCK hücreleri ve C. elegans bağırsak içinde anılan sıraya göre son zamanlarda hücre içi de için kaçakçılık zorunluluğu belirledik Novo (apikal) etki alanı ve Lümen Biyogenez ve11,12,13konumlandırma. Kalınlığı (düz karşı) borulu epitel hücreleri biridir bir avantaj hücre altı asimetriler 3D analizi için üstün bir görsel ayrım apikal lumenal membran, apico-lateral kavşaklar, yanal membran, izin verir bu yana ve Hücre içi organellerin pozisyonlar. Bu görsel avantajları, C. elegans model ekler vücut planı, sabit ve tanımlı hücre soy, analitik sadeliği içinde vivo ayarı, gelişimsel eksen, saydamlık (genetik) ve ek avantajlar aşağıda açıklanmıştır.

C. elegans kendisi olan şeffaflık ve basit mimarisi, aynı şekilde borulu iç organları doğrudan tüp ve Lümen morfogenez görsel analiz için erişilebilir duruma tübüler yapısının yuvarlak bir kurt var. Onun bağırsak (zaman zaman 21 ya da 22 hücreleri)14 yirmi hücreleri bir tek progenitör hücre (E) elde edilen ve bir çift katlı epitel tarafından bir enterkalasyon adım 9 INT yüzük bilateral simetrik bir tüp içine geliştirmek (dört hücreleri ilk halka; Şekil 1 şematik)14,15,16. Başlangıçta Nomarski optik nükleer kimlikleri17ile ve daha sonra Floresans mikroskobu etiketli membranlar yoluyla tarafından belirlenen bağırsak’ın soy ve doku analizi, onun morfogenez, kritik anlayışlar içinde sağlamıştır belirli hücre özerk ve hücre-sigara özerk gereksinimleri yönlü hücre bölünmeler ve hareketleri (örneğin, enterkalasyon, sağ-sol asimetriler, anterior ve posteiror tüp döndürme)14,18 . Erken endodermal hücre özellikleri ve bu klonal modeli organ gelişimi kontrol gen düzenleyici ağ de karakterize19,20vardır. Burada, ancak, polarize membran ve Lümen Biyogenez tek tübüler hücrelerde ve endomembranes, hücre iskeleti yapıları ve bu sürecine eşlik organellerin hücre içi asimetriler analizine odaklanmıştır. Analiz nerede tüm apikal membranlar (ultrastructural düzey microvilli tarafından ayırt edici) Lümen yüz ve tüm Bazal membran dış boru yüzey birbirlerine temas yanal membranlar ile yüz bu tüp sadeliği tarafından yönetilir, apikal membran kavşaklar tarafından ayrılmış (şekil 1 şematik; bkz: başvuruları (16,21) C. elegans-özel organizasyon sıkı ve adherens junction bileşenleri). Apikal membran Biyogenez böylece Lümen morfogenez ile çakışık olduğunu. Ayrıca, Yetişkin bağırsak hücreleri – en büyük bu küçük hayvan hücreleri (boşaltım hücrenin özel durumla) – boyutunu yaklaşık vivo içinde görsel izleme hücre altı öğe, örneğin izin bir memeli hücre boyutu genellikle vezikül yörüngeleri vitro kültür tabak içinde çalıştı.

Bu hücre ve hücre altı çözümleme amacıyla uygun etiketleme önemlidir. Bağırsak endo veya plazma zarı etki alanları, kavşaklar, hücre iskeletiyapıları, çekirdek ve hücre altı diğer organelleri belirli moleküler bileşenleri etiketleme tarafından görüntülenmiştir. Böyle birçok bileşenleri ile karakterize ve keşfedilmeyi devam (tablo 1 birkaç örnek verir ve kaynaklara anlamına gelir). Örneğin, çeşitli moleküller yolu ile plazma zarı için yazı-Golgi veziküller Golgi acil servise gelen bağırsak endomembrane sisteminin borulu ve/veya veziküler bölmeleri ayırt tanımlanan22olmuştur. Belirli proteinler (yanı sıra lipidler ve şeker) de doğrudan veya dolaylı olarak protein bağlayıcı üzerinden etiketli. Bu iletişim kuralı in situ antikor sabit örnekleri, iki standart etiketleme teknikten birini boyama üzerinde duruluyor (eşlik eden kağıt boşaltım kanalı tubulogenesis diğer tekniği2 – bir açıklaması için bkz: vivo etiketleme Floresan protein füzyon – bağırsak için doğrudan geçerli olduğu; Tablo 2 bağırsak için ifade gibi füzyon proteinlerin sürücü için kullanılan bağırsak özel Organizatör örnekleri sağlar). Çift – veya her iki yaklaşım, veya her iki artı ek kimyasal boyama, karışımı ile birden fazla etiketleme daha fazla derinlemesine görsel çözünürlüğünü ve co yerelleştirme kayma ve zamansal değişikliklerinin incelenmesi ve özel alımı sağlar molekülleri veya hücre altı bileşenlerinin (Şekil 2). Fiksasyon ve bu iletişim kuralı desteği korunması immunostaining işlemler sırasında etiketleme yeşil flüoresan protein (GFP) açıklanan yordamları boyama. Görüntüleme için anahtar noktaları algılama ve karakterizasyonu fenotipleri standart mikroskobik prosedürler (floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu) ile olan tubulogenesis ()şekil 3, 4açıklanan). Bunlar daha yüksek çözünürlük örnek superresolution mikroskobu ve transmisyon elektron (burada açıklanmayan) mikroskopi için yaklaşımlar görüntüleme için genişletilebilir.

Bu sistem bir anahtar gücü embriyogenez yetişkinlik aracılığıyla gelen farklı gelişim aşamalarında polarite tek tek hücreleri içinde çözümlenecek yeteneğidir. Örneğin, apikal membran etki alanı ve Lümen Biyogenez geliştirme tek hücre düzeyinde boyunca ERM-1, Ezrin-Radixin-Moesin aile23,24 son derece korunmuş membran-aktin bağlayıcı ile etiketleme yoluyla izlenebilir . Kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve göç (Lümen enterkalasyon sırasında etrafında apically hücreleri hareket)15ile ortaya çıktığında ERM-1 sırasında embriyonik tüp morfogenez, apikal membran dipnotlar (1) görüntüler; (2) hücre bölünmesi veya geçiş yokluğunda gelirleri geç embriyonik ve larva tüp uzantısı sırasında; ve (3) Yetişkin bağırsakta nerede polarize membran etki alanları (şekil 1) korunur. Genişleyen sonrası Mitotik larva epitel içinde de novo polarize membran Biyogenez böylece ayrılabilir çoğu in vivo ve in vitro epitel polarite modellerinde mümkün değildir, polarize doku morfogenez Bu tek hücreli çözünürlük (örneğin 3D MDCK kist modeli8) dahil. Diğer bileşenler için etiketleme ile bu ayarı (hücreleri daha yüksek bir sitoplazma/çekirdek oranı varsa özellikle L1 larva aşamasında) fırsat sağlar özgü bu hücre içi değişiklikleri ayırt etmek için polarize membran dipnotlar () örneğin kaçakçılığı yörüngeleri hale gelmesini) bu kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş için gerekli.

C. elegans genetik çok yönlülük iyi bilinen25ve biyolojik herhangi bir soru moleküler analiz için güçlü modeli sistem yapar. Morfogenez, üzerine bir çalışma, bir vahşi tipi yük, faiz (örneğin bir membran) yapısını floresan bir marker ile veya bir kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu mutant bir üründe ile ile nerede etiketli bir transgenik yük ile başlayabilirsiniz yapısı. Tipik bir ters genetik çalışma germline (örneğin tarafından hedeflenen silme), mutagenesis (genellikle nokta mutasyonlar sonucu kaybı, azaltılması ya da kazanç fonksiyonu ile üreten değiştiren bir mutant gen ilgi silinmesi oluşturabilir Gen) veya nerede onun transkript RNAi tarafından düşürülür. C. elegans26 besleme tarafından RNAi kolaylığı da ilgi genlerin daha büyük bir grup incelemek hedeflenen ekranlar için tasarım oldukça rahat. Bir genetik model organizma’nın tartışmasız en güçlü bir fenotip moleküler nedeni tarafsız bir soruşturma izni vivo içinde ileri ekranlar (örneğin mutagenesis, sistematik veya genom geniş RNAi ekranlar) yapmak için yeteneğidir faiz. Örneğin, tarafsız bir görsel C. elegans RNAi tubulogenesis ekran, apikal membranlar, ERM-1 olarak etiketlenmiş transgenik bir hayvanla ile başlayan bir ilgi çekici tersinir bağırsak polarite dönüşüm ve Ektopik Lümen fenotip, kullanılan keşfetti Burada bu tür analiz için bir örnek olarak. Bu ekran glycosphingolipids (GSLs; onların GLS biyosentetik enzimler ile tanımlanan zorunlu membran lipidler) tükenmesi ve vezikül kat clathrin ve onun AP-1 adaptör bileşenleri bu polarizasyona neden belirli moleküler kusurlar tespit dönüşüm fenotip, böylece bunlar molekülleri in vivo kaçakçılığı karakterize apikal membran polarite ve Lümen12,13konumlandırma için ipuçları. Ayrıca belirli genetik mutasyon/morfogenez fenotip ile Başlarken, bu tür ekranları (veya tek genetik/RNAi etkileşim deneyler) iki veya daha fazla faiz (bkz: kağıt üzerinde boşaltım eşlik eden genler arasındaki işlevsel etkileşimler inceleyebilirsiniz Canal böyle bir analiz örneği için)2. Bu iletişim kuralı hangi ek olarak doğrudan kimin fenotip ileri ekranları kaybolmasına neden gen tanımlama yeteneği onun morfogenez çözümlemesi için belirli avantajlar sağlayan RNAi odaklanır. Gen ürünü morfogenez kez yönetmenlik bir doz bağımlı biçimde çalışır beri RNAi fenotipleri bir spektrum oluşturmak için genellikle başarılı olur. Bilgilendirici işlevi, kısmi kaybı fenotipleri oluşturma yeteneği de önemli tubulogenesis genler çoğunluğu gerekli ve onların kayıpları kısırlık ve erken embriyonik ölümcül neden sorunu çözmek için yardımcı olur. Bu iletişim kuralı bu zorluk üstesinden gelmek için koşullu RNAi stratejileri içerir ve fenotipleri, mutagenesis tarafından üretilen bir allelic serisi gibi daha geniş bir spektrum nesil optimize etmek için yollar önerir.

Protocol

1. C. elegans bağırsak etiketleme Not: boşaltım kanalı tubulogenesis 2 doku belirli floresan marker inşası için analiz yazarlar tarafından eşlik eden kağıt görmek Plazmid ve Transjenik hayvanlar transkripsiyon ve çevirim füzyon protein (ikinci faiz molekülünün hücre altı yerelleştirme için gerekli) üzerine tartışmalar da dahil olmak üzere, nesil. Bu yordamları faiz molekülünün bağırsak için sürücü için belirli Organizatör …

Representative Results

Bu iletişim kuralı, tatlı analiz ve polarize membran Biyogenez ve Lümen morfogenez C. elegans bağırsakta tek hücre ve hücre altı düzeyde görselleştirmek açıklar. Yirmi-hücre tek katmanlı C. elegans bağırsak yönlendirilmiş hücre bölünmesi ve geçiş sırasında orta embriyo tarafından oluşturulur. Etki alanları kurulan haline bu zaman, polarize membran, yine de novo , polarize membran Biyogenez olgun içinde devam eder ancak epitel dört…

Discussion

Bu iletişim kuralı standart fonksiyon kaybı genetik/RNAi ve C. elegans bağırsak epitel görsel ve moleküler diseksiyon içinde vivo için bir model olarak yararlanmak için (etiketleme ve mikroskobik) yaklaşımlar Imaging birleştirmek açıklar polarize membran ve Lümen Biyogenez.

Etiketleme

Bu iletişim kuralı antikor boyama üzerinde duruluyor. Situ antikorlar tarafından etiketleme floresan füzyon (eşlik ede…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mario de teşekkür ediyoruz Bono (Moleküler Biyoloji laboratuarında, Cambridge, İngiltere), Kenneth J. Kemphues (Cornell Üniversitesi, Ithaca, ABD), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Fransa), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Fransa) ve suşları ve antikorlar için araştırma altyapı programları (P40 OD010440), NIH ofisi tarafından finanse CGC. Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22×22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

References

  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
  21. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  22. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  23. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 遗传学. 77, 71-94 (1974).
  24. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  25. Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  26. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  27. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
  28. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  29. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  30. Netherlands, S. . Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , (2008).
  31. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  32. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  33. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
  34. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  35. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  36. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  37. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  38. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  39. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  40. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Play Video

Cite This Article
Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

View Video