El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

La generación de las asimetrías celulares y subcelulares, tales como la formación de dominios de membrana polarizada, es esencial para la morfogénesis y la función de las células, tejidos y órganos¹. Los estudios en la biogénesis de la membrana polarizada en epitelios siguen siendo un desafío técnico, puesto que los cambios de dirección en la asignación de componentes subcelulares dependen de múltiples consecutivas coincidentes extracelulares e intracelulares señales y que son difíciles de separar en la mayoría de los modelos y depende fuertemente del sistema de modelo. El modelo presentado aquí – la sola capa intestino elegans de Caenorhabditis – es un tejido de exquisita sencillez. Junto con la sola célula C. elegans excretor canal (ver acompañando a papel en la biogénesis de la membrana polarizada en el canal excretor de C. elegans ) de², ofrece varias ventajas únicas para la identificación y caracterización de moléculas requeridas para la biogénesis de la membrana polarizada. La conservación de señales de polaridad molecular de levaduras al hombre hacer este simple órgano invertebrado un excelente“en vivo cámara de tejido” para responder preguntas sobre la polaridad epitelial que son de interés directo para el sistema humano, que es todavía demasiado complejo para permitir la disección visual de estos eventos en el solo nivel en vivode la célula.

Aunque múltiples señales de polaridad conservado de (1) la matriz extracelluar (2) la membrana plasmática y sus uniones y tráfico vesicular (3) intracelular han identificado³, los principios subyacentes de su integración en el proceso de biogénesis de la membrana y el tejido epitelial polarizada es mal entendido⁴. Los modelos de unicelular clásica en vivo (e.g.S. cerevisiae y C. elegans zygote) han sido fundamentales en la definición de los principios de división de célula polarizada y polaridad antero-posterior y han identificado importantes polaridad de membrana asociados determinantes (las pequeñas GTPasas/CDC-42, las igualdades de la partición defectuosa)^5,6, pero dependen única simetría romper señales (cicatriz del brote, la entrada de esperma) y carecen de seguro de cruce Dominios de membrana apicobasal y, probablemente, el correspondiente apicobasal intracelular maquinaria de clasificación. Nuestros conocimientos actuales sobre la organización del tráfico polarizado de epitelios, sin embargo, principalmente se basa en monocultivos 2D mamíferos⁷, que carecen de señales extracelulares y de desarrollo fisiológicos que pueden cambiar la posición de la membrana Dominios y direcciones de las trayectorias de la trata de personas (un cambio de 2D a 3D en vitro sistemas de cultivo solo basta para invertir la polaridad de la membrana en las células MDCK (riñón canino Madin-Darby))⁸. Inicialmente se realizaron in vivo del desarrollo estudios en polaridad epitelial en los organismos modelo de invertebrado en epitelios planos, por ejemplo en la epidermis de Drosophila melanogaster , donde identificó la contribución crítica dinámica de cruce para la migración de la célula polarizada y célula de movimiento de la hoja⁹y endocíticas trata de polaridad mantenimiento¹⁰. El 3D en vitro y en vivo análisis de la morfogénesis de lumen en epitelios tubulares en las células MDCK y en el intestino de C. elegans , respectivamente, han identificado recientemente el requisito del tráfico intracelular de de Novo dominio (apical) y biogénesis de lumen y posicionamiento^11,12,13. El grosor del tubular (frente plano) células epiteliales es una ventaja para el análisis 3D de asimetrías subcelulares puesto que permite una distinción visual superior de la membrana apical lumenal, ensambladuras apico lateral, la membrana lateral y el posiciones de los organelos intracelulares. A estas ventajas visuales, el modelo de C. elegans añade el ajuste en vivo , eje del desarrollo, transparencia, simplicidad de plan corporal, linaje de la célula invariable y definida, analítico (genética) y ventajas adicionales que se describen a continuación.

C. elegans sí mismo es un nemátodo de estructura tubular cuya transparencia y arquitectura simple hace sus órganos internos además tubulares directamente accesible al análisis visual de la morfogénesis del tubo y del lumen. Las veinte células de su intestino (células de 21 o 22 en ocasiones)¹⁴ se derivan de una célula del progenitor único (E) y desarrollo de un epitelio de dos capas por un paso de intercalación en un tubo bilateral simétrico de nueve anillos INT (cuatro células en la primer anillo; Figura 1 esquema)^14,15,16. Análisis de linaje y el tejido del intestino, inicialmente determinado por óptica Nomarski mediante identidades nuclear¹⁷y posteriormente por microscopía de fluorescencia a través de membranas marcadas, ha proporcionado penetraciones críticas en su morfogénesis, en particular los requisitos célula autónoma y celular no autónomos para sus divisiones de célula direccionales y movimientos (p. ej., intercalación, asimetrías de derecha a izquierda, rotación del tubo anterior y posterior)^14,18 . Especificación de células endodérmicas temprano y la red reguladora genes controlan el desarrollo de este órgano modelo clonal son bien caracterizado^19,20. Aquí, sin embargo, se trata en el análisis de membrana polarizada y biogénesis del lumen de las células tubulares y de las asimetrías intracelulares de endomembranas, citoesqueleto estructuras y organelos que acompañan este proceso. El análisis se facilita por la simplicidad de este tubo, donde todas las membranas apicales (en el nivel ultraestructural por microvellosidades) ante la luz y todas las membranas basales frente a la superficie externa del tubo, con membranas laterales toquen, separada de la membrana apical por uniones (esquema de lafigura 1 , ver referencias (^16,21) para C. elegans-organización específica de apretado y componentes de ensambladura de los adherens). Biogénesis de la membrana apical es coincidente con la morfogénesis del lumen. Además, el tamaño de las células intestinales adultos – las células más grande de este pequeño animal (con excepción de la célula excretora) – aproximar el tamaño de una célula mamífera, permitiendo el seguimiento visual en vivo de los elementos subcelulares, p. ej. trayectorias de la vesícula, que suele ser intentaron en vitro en una placa de cultivo.

Con el propósito de este análisis celular y subcelular, etiquetado adecuado es fundamental. Dominios de membrana intestinal endo o plasma, ensambladuras, citoesqueletolas estructuras, los núcleos y otros organelos subcelulares pueden ser visualizados por sus componentes moleculares específicos de etiquetado. Muchos componentes se han caracterizado y siguen a descubrirse (tabla 1 da algunos ejemplos y se refiere a los recursos). Por ejemplo, varias moléculas de distinción de los compartimentos del Sistema endomembranoso intestinal, tubulares o vesiculares de la ER al Golgi vía vesículas post-Golgi a la membrana plasmática, han sido identificados²². El específico proteínas (como los lípidos y azúcares) pueden bien etiquetarse directamente, o indirectamente a través de las proteínas. Este protocolo se centra en situ tinción de anticuerpos de muestras fijas, una de dos técnicas de etiquetado estándar (consulte el documento adjunto en canal excretor tubulogenesis para una descripción de los otros técnica² – en vivo de etiquetado a través de fusiones de la proteína fluorescente – que es directamente aplicable al intestino; Tabla 2 proporciona ejemplos de promotores específicos del intestino que pueden utilizarse para impulsar la expresión de estas proteínas de fusión en el intestino). Doble o múltiples etiquetado con cualquier enfoque o con una combinación de ambos plus adicional química coloración, permite una mayor resolución visual detallada y el examen de los cambios espaciales y temporales en la localización y contratación de la específico las moléculas o de los componentes subcelulares (figura 2). La fijación y tinción de los procedimientos descritos en esta preservación de soporte de protocolo de la proteína fluorescente verde (GFP) etiquetado durante el procedimiento de inmunotinción. Para la proyección de imagen, principales puntos de la detección y caracterización de los fenotipos mediante procedimientos microscópicos (microscopía de fluorescencia confocal y disección) son tubulogenesis describe ()figura 3, 4). Estos pueden ampliarse a enfoques, por ejemplo superresolution transmisión y microscopía microscopía electrónica (no descrita aquí) la proyección de imagen de resolución más alta.

Una fuerza de este sistema es la capacidad de analizar la polaridad de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, de la embriogénesis hasta la edad adulta. Por ejemplo, biogénesis de la membrana apical dominio y luz pueden ser rastreada a lo largo desarrollo en el nivel unicelular mediante etiquetado con ERM-1, un enlazador de membrana muy conservada-actina de Ezrin-Radixin-moesina familia^23,24 . ERM-1 visualiza la biogénesis de la membrana apical (1) durante la morfogénesis del tubo embrionario, cuando se produce concomitantemente con división de célula polarizada y migración (movimiento de las células apicalmente alrededor del lumen durante intercalación)¹⁵; (2) durante la última extensión del tubo embrionario y larval que procede en ausencia de división celular o la migración; y (3) en el intestino adulto, donde los dominios de membrana polarizada se mantienen (figura 1). En el epitelio larvas poste-mitotic creciente, de nuevo polarizado membrana biogénesis se puede separar así de morfogénesis de tejidos polarizados, que no es posible en modelos de polaridad epitelial más en vivo y en vitro , los unicelulares resolución (por ejemplo el 3D MDCK quiste modelo⁸) incluidos. Con el etiquetado de los demás componentes, esta configuración proporciona la oportunidad (especialmente en la etapa larval L1 cuando las células tienen una mayor relación citoplasma/núcleo) distinguir los cambios intracelulares que son específicos de polarizado (de la biogénesis de la membrana por ejemplo, la reorientación de las trayectorias de la trata de personas) de los concomitante para la migración y división de célula polarizada.

La versatilidad genética de C. elegans es conocida²⁵y es un sistema potente para el análisis molecular de cualquier cuestión biológica. Un estudio sobre morfogénesis, por ejemplo, puede empezar con una cepa de tipo salvaje, una cepa transgénica donde la estructura de interés (por ejemplo, una membrana) se etiqueta con un marcador fluorescente, o con un mutante de la pérdida o ganancia de función con un defecto en este estructura. Un típico estudio genético inverso puede generar a un mutante en el gen de interés se elimina en el germline (e.g. por una eliminación específica), modificado por mutagénesis (suelen producir mutaciones puntuales con la consiguiente pérdida, reducción o aumento en la función del gen), o que su transcripción es reducido por RNAi. La facilidad de RNAi por alimentación en C. elegans²⁶ también se presta al diseño de pantallas específicos que examinan un grupo de genes de interés. Podría decirse que mayor fortaleza de un organismo modelo genético es la capacidad para llevar a cabo en vivo adelante pantallas (por ejemplo, mutagénesis, sistemáticas o genoma pantallas de RNAi) que permitan una investigación imparcial en la causa molecular de un fenotipo de interés. Por ejemplo, una visual imparcial RNAi C. elegans tubulogenesis pantalla, a partir de un animal transgénico con membranas apicales marcada con 1 ERM, descubrió una interesante conversión reversible polaridad intestinal y fenotipo lumen ectópico, utilizado aquí como un ejemplo de este tipo de análisis. Esta pantalla denominará el agotamiento de los glicoesfingolípidos (GSLs; lípidos de membrana obliga, identificados a través de sus enzimas biosintéticas para el GLS) y componentes de la clatrina de capa de la vesícula y su adaptador AP-1 los defectos moleculares específicos que causan esta polaridad fenotipo de conversión, de tal modo caracterizar estos trata de moléculas en vivo señales de polaridad de la membrana apical y lumen posicionamiento^12,13. Cuando a partir de un fenotipo de la mutación genética específica/morfogénesis, esas pantallas (o experimentos de interacción genética/ARNi sola) también pueden examinar las interacciones funcionales entre dos o varios genes de interés (ver acompañando a papel en el excretor canal para obtener un ejemplo de dicho análisis)². Este protocolo se centra en ARNi que, además de su capacidad para identificar directamente el gen cuya pérdida provoca el fenotipo en las pantallas hacia adelantadas, proporciona ventajas específicas para el análisis de la morfogénesis. Desde productos de gen dirigir morfogénesis a menudo trabajan de manera dependiente de la dosis, ARNi generalmente es exitoso en la generación de un espectro de fenotipos. La capacidad de generar fenotipos de pérdida parcial de función informativos también ayuda a resolver el problema que la mayoría de los genes tubulogenesis importantes es esencial y que sus pérdidas causan esterilidad y mortalidad embrionaria temprana. Este protocolo incluye estrategias de RNAi condicionales para superar esta dificultad y sugiere formas para optimizar la generación de un espectro más amplio de fenotipos, como una serie alélica producida por mutagénesis.