Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi
Summary
Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız.
Abstract
Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi su organizmalarında hipoksinin etkilerini incelemek için geliştirdiğimiz hipoksi indüksiyonu için yeni bir sistem sunuyoruz. Sistemimiz, seçime bağlı herhangi bir deneysel solüsyonda spesifik bir oksijen konsantrasyonunu ve sıcaklığını sağlamak ve korumak için sağlam olan basit bir düzen içeren bir hazneyi içermektedir. Sunulan sistem çok uygun fakat son derece fonksiyoneldir, in vivo doğrudan deneyler için ve 48 saate kadar çeşitli zaman periyodlarında indüksiyon ve hipoksinin sürdürülmesine izin verir.
Hipoksinin etkilerini izlemek ve incelemek için iki yöntem kullandık – tüm embriyolar veya spesifik dokularda hipoksi ile uyarılabilir faktör 1alfa (HIF-1α) seviyelerinin ölçülmesi ve retinal kök hücre çoğalmasının belirlenmesinde 5-etinil-2'- Deoksiuridin (EdU) DNA'ya dahil edilmesi. HIF-1α seviyeleri tüm embriyo veya dokuda genel hipoksi belirteci olarak görev yapabilirBurada, embriyonik retina seçimi. Embriyonik retinanın çoğalan hücrelerine EdU'nun dahil edilmesi hipoksi indüksiyonunun spesifik bir çıktısıdır. Böylece, hipoksik embriyonik retinal progenitörlerin hem kurbağa hem de zebra balığı embriyolarının% 5'inin oksijen altında inkübasyonun 1 saat içinde proliferasyonu azalttığını gösterdik.
Hakim olduktan sonra, kurulumumuz, doğrudan in vivo deneyler için, herhangi bir belirli periyot için ve normal, hipoksik veya hiperoksit oksijen konsantrasyonu altında veya herhangi bir diğer verilen gaz karışımında, küçük su ürünleri model organizmaları ile birlikte kullanılmak üzere kullanılabilir.
Introduction
Hypoxia araştırması çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bunlar, hipoksi 1 ve akut yüksek rakım hastalığı 2 ile karakterize edilen tıbbi koşullar için patogenezi araştırmak ve tedavileri geliştirmektir. Hipoksik stres, oksijen gerektiren tüm organizmalarda önemli metabolik değişikliklere neden olur. Hipoksik stres ayrıca fetusun büyümesini ve gelişimini ve intrauterin büyüme kısıtlamasını da içeren çeşitli insan hastalıklarının patogenezini etkiler. Hipoksik stres, doğum kilosunun, fetal ve neonatal mortalitenin azalmasına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda kardiyovasküler hastalık, tip-2 diyabet, obezite ve hipertansiyon 4 gibi yetişkinlikte birçok komplikasyona neden olabilir. Hipoksik stres, sıklıkla tümörün gelişimi sırasında, tümör dokusu kan dolaşımını zorlaştıracağında da görülür. Bu nedenle , in vivo ve doğrudan embr sırasında hipoksi etkilerini incelemek mümkün önemlidir Yonic gelişme.
Gelişme sırasında hipoksi etkilerini incelemek için kullanılan en iyi bilinen yöntemler arasında, büyüme ortamında kobalt klorür kullanılması veya organizmanın hipoksit bir bölgede kuluçkalanması bulunur. Kobalt klorür, proteozomal bozunmayı önleyerek hipoksi-indüklenebilir faktör-1 alfa (HIF-1α) 'nın stabilizasyonundaki rolü nedeniyle yapay olarak normal oksijen konsantrasyonu altında hipoksik bir tepki uyandırır 5 , 6 , 7 . Bununla birlikte, uygun bir yöntem olan 8 , kobalt klorür ve diğer benzer kimyasal hipoksi mimetiklerinin kullanımı, hücreler ve dokular üzerinde spesifik olmayan zararlı etkilere, örneğin apoptoz 9'a neden olabilir . Dolayısıyla, hipoksik odalar normal gelişim sürecinde canlılardaki "doğal hipoksi" oluşumunda daha iyi bir yöntemdir.
Ntent "> Suda yaşayan hayvan embriyolarında hipoksi teşvik sistemi geliştirmeye odaklandık Hem kurbağalar hem de zebra balığı birçok biyolojik sürecin yanı sıra çeşitli insan hastalıkları modelleri için omurgalı model organizmalar haline geldi Frog ve zebra balığı embriyoları Maternal tazminatın komplikasyonunu ortadan kaldırarak harici olarak gelişir.Ayrıca, hızlı bir gelişim seyri, çevresel faktörleri manipüle etmeyi ve organ oluşumundaki fenotipik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemeyi mümkün kılar.Ayrıca, büyük sinyal iletim yollarının birçok bileşeni, Bu model organizmalar ve geniş bir literatür tarafından detaylandırılmışlardır Kurbağalar ve zebra balığı embriyolarının hipoksinin omurgalıların gelişimi üzerindeki etkilerini incelemekteki ana avantajı oksijenin embriyolara çabucak nüfuz etmesi nedeniyle tüm proseslerin doğrudan izlenebilmesidir. Böylece kurbağalar ve zebra balığı gibi, diğer model organizmaların aksineFare embriyolarında, spesifik bir oksijen konsantrasyonunun etkisi, işlevsel vaskülatürün varlığını veya eksikliğini göz önüne almadan, ilgi dokusunda incelenebilir.Piyasada bulunan hipoksik inkübasyonun çoğu kurulumu, karşılaştırılabilir büyüklükte ve buna bağlı olarak yüksek işletme maliyetlerine sahip olma dezavantajına sahiptir. Yüksek başlangıç maliyeti ve gaz tüketiminin yanı sıra, ortak hipoksi odalarının dengelenmesi ve bakımı, daha büyük boyut ve / veya organizma solunumundan dolayı doğal olarak bu odacıklarda oluşan gaz gradyanına karşı sabit hipoksik atmosferin sürdürülmesini gerektirir. Bu, gaz fanlarının ve soğutma sisteminin kullanılmasını gerektirir; bu soğutma sistemi, gerekli ek donanım miktarını arttırır, araştırmacının becerisini engeller ve genel olarak deneysel prosedürün basitliğini azaltır. Buna karşın, burada sunduğumuz kurulum, karşılaştırılabilir sağlam ancak çok düşük maliyetli, küçük, kurulması kolay ve fAst gazı dengelemesi, dengeli hipoksik atmosfer ve odacık içindeki malzeme ve solüsyonların basit bir şekilde değiş tokuşu. Sistemimiz, herhangi bir suda yaşayan herhangi bir organizma organizmasıyla kullanılmak üzere istihdam edilebilir.
Elverişli olarak küçük olan ve dolayısıyla herhangi bir sıcaklıkta deneysel prosedürlere kolayca izin veren ortak bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirilebilen bir hipoksik oda oluşturduk. Ortamda oksijen konsantrasyonunun yanı sıra sıcaklığın uygun bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak, sistemimizin piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerine karşı avantajı küçük boyut ve maliyet etkinliğidir. Dolayısıyla, kurulumumuz, araştırma laboratuvarlarının çoğunluğu için mevcut olan genel laboratuar malzemeleri kullanılarak kurulabilir ve pahalı malzemeler gerektirmez. Ek olarak, kurulumumuz piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerinin aksine ısı üretmez ve oda sıcaklığının altındaki sıcaklıklarda inkübatöre konulmasını sağlar. LaSt özellikle gelişimsel ve metabolik oranlara sıcaklığa bağlı olan kurbağalar ve balık gibi soğuk kanlı organizmalar ile çalışmak için kritik önem taşır.
Çok düşük maliyetli ve kolayca kurulabilen gaz kuluçka haznemiz, çeşitli hipoksik veya hiperoksik koşulların oluşturulmasında çok yönlüdür ve geniş bir deney koşulları için farklı ortam ve solüsyonların hızlı ve kolay uygulanmasını sağlar. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan tabaklar veya laboratuvar tankları yerine 10'luk , 11'inci , 12'li olmak üzere 24'lü bir plak kullanan sistemimiz, aynı anda birkaç mutant koşulun gözlemlenmesine ve deneysel olarak işlemesine izin verir.
Doğru hipoksinin indüksiyonunu kontrol etmek için Western blot tespiti ile HIF-1α protein seviyelerini izledik. Buna ek olarak, inkübasyondan önce ve sonra çoğalan hücrelerin sayısıHipoksik odadaki n, dokuda hipoksi oluştuğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hipoksi öncesi embriyonik retinal kök hücre nişinde çoğalmanın azaldığını gösteren daha önce yayınlanmış sonuçlarımıza 13 dayanır. Bu nedenle, embriyo ortamına 5-etinil-2'-deoksiuridin (EdU) ekleyerek ve yeni çoğalmakta olan hücrelerin DNA'sına dahil edilmesini ölçerek retinal kök hücre çoğalmasının seviyesini izledik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyolarıyla kullanılmak üzere ayarlanmış, ancak diğer su organizmaları için de uygun olan hipoksiyi indüklemek için kolay ama sağlam yeni bir yöntem sunduk. Bu yöntemin en büyük avantajı basitliği ve maliyet etkinliğidir. Bununla birlikte, bu yöntemle elde edilen sonuçlar çok sağlamdır. Hipoksinin odadaki hem tüm embriyolar hem de spesifik doku – burada retinalar – içinde etkili bir şekilde indükte edilebileceğini gösterdik. Hipoksi indüksiyonunun etki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Wellcome Trust SIA Ödülü 100329 / Z / 12 / Z'den WAH'ya ve DFG bursu KH 376 / 1-1'e Destek ile desteklendi.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
