Summary

Induction de l'hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Published: June 26, 2017
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Summary

Nous présentons un nouveau système de chambre hypoxique à utiliser avec des organismes aquatiques tels que des embryons de grenouille et de poisson zèbre. Notre système est simple, robuste, rentable et permet l'induction et le maintien en puissance de l'hypoxie in vivo et jusqu'à 48 h. Nous présentons 2 méthodes reproductibles pour surveiller l'efficacité de l'hypoxie.

Abstract

Ici, nous introduisons un nouveau système pour l'induction de l'hypoxie, que nous avons développé pour étudier les effets de l'hypoxie chez les organismes aquatiques tels que les embryons de grenouille et de poisson zèbre. Notre système comprend une chambre avec une configuration simple qui est néanmoins robuste pour induire et maintenir une concentration et une température d'oxygène spécifiques dans n'importe quelle solution expérimentale de choix. Le système présenté est très rentable mais très fonctionnel, il permet l'induction et le maintien en puissance de l'hypoxie pour des expériences directes in vivo et pour différentes périodes jusqu'à 48 h.

Pour surveiller et étudier les effets de l'hypoxie, nous avons utilisé deux méthodes: la mesure des niveaux de facteur 1alpha inducible à l'hypoxie (HIF-1α) dans des embryons entiers ou des tissus spécifiques et la détermination de la prolifération des cellules souches de la rétine par 5-éthynyl-2'- Incorporation de désoxyuridine (EdU) dans l'ADN. Les niveaux de HIF-1α peuvent servir de marqueur d'hypoxie générale dans l'ensemble de l'embryon ou du tissuDe choix, ici la rétine embryonnaire. L'incorporation d'EdU dans les cellules proliférantes de la rétine embryonnaire est une production spécifique d'induction d'hypoxie. Ainsi, nous avons montré que les progéniteurs de rétine embryonnaire hypoxique diminuent la prolifération dans les 1 h d'incubation sous 5% d'oxygène des embryons de grenouille et de poisson zèbre.

Une fois maîtrisé, notre installation peut être utilisée pour être utilisée avec de petits organismes modèles aquatiques, pour des expériences directes in vivo , une période de temps donnée et sous une concentration d'oxygène normale, hypoxique ou hyperoxyde ou sous tout autre mélange de gaz donné.

Introduction

La recherche sur l'hypoxie comporte de nombreuses applications. Il s'agit notamment d'enquêter sur la pathogenèse et de développer des traitements pour les affections médicales caractérisées par une hypoxie 1 et une maladie aiguë de haute altitude 2 . Le stress hypoxique entraîne des changements métaboliques majeurs chez tous les organismes nécessitant de l'oxygène. Le stress hypoxique influence également la croissance et le développement du fœtus et la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, y compris la restriction de la croissance intra-utérine 3 . Le stress hypoxique peut non seulement entraîner une réduction du poids à la naissance, la mortalité du foetus et du néonatale, mais aussi entraîner de nombreuses complications dans la vie adulte, telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, l'obésité et l'hypertension 4 . Le stress hypoxique est également souvent observé lors du développement de la tumeur solide, lorsque le tissu tumoral dépasse son apport sanguin. Il est donc crucial de pouvoir étudier les effets de l'hypoxie in vivo et directement pendant l'embryon Développement yonique.

Parmi les méthodes les plus connues qui ont été utilisées pour étudier les effets de l'hypoxie au cours du développement, il y a l'utilisation de chlorure de cobalt dans le milieu de croissance ou l'incubation de l'organisme dans une chambre hypoxique. Le chlorure de cobalt induit artificiellement une réponse hypoxique sous une concentration normale d'oxygène, en raison de son rôle dans la stabilisation du facteur 1 inducible par l'hypoxie (HIF-1α) en empêchant sa dégradation protéosomale 5 , 6 , 7 . Cependant, étant une méthode pratique 8 , l'utilisation de chlorure de cobalt ainsi que d'autres mimétiques d'hypoxie chimique similaires peut avoir un effet délétère non spécifique sur les cellules et les tissus, par exemple , l'apoptose 9 . Par conséquent, les chambres hypoxiques sont une meilleure méthode pour l'induction de «l'hypoxie naturelle» dans les organismes vivants au cours du développement normal.

Nous nous sommes concentrés sur le développement d'un système d'induction de l'hypoxie chez les embryons d'animaux aquatiques. Les grenouilles et le poisson zèbre sont devenus des organismes modèles informatifs à base de vertébrés pour des études sur de nombreux processus biologiques, ainsi que des modèles pour diverses maladies humaines. Se développent à l'extérieur, éliminant la complication de la compensation maternelle. En outre, un développement rapide permet de manipuler les facteurs environnementaux et d'observer les changements phénotypiques dans la formation des organes en temps réel. En outre, de nombreux composants des voies principales de transduction du signal sont fortement conservés Ces organismes modèles et ont été caractérisés en détail par une large littérature. Le principal avantage de l'utilisation de grenouilles et d'embryons de poissons zèbres pour étudier les effets de l'hypoxie sur le développement des vertébrés est que tous les processus peuvent être surveillés directement, car l'oxygène pénètre rapidement dans les embryons. Ainsi, dans les grenouilles et le poisson zèbre, contrairement aux autres organismes modèles tels queEmbryons de souris, l'influence d'une concentration d'oxygène spécifique peut être étudiée dans le tissu d'intérêt, sans tenir compte de la présence ou du manque de système vasculaire fonctionnel.

La plupart des configurations disponibles dans le commerce pour l'incubation hypoxique présentent l'inconvénient d'être relativement importantes et d'avoir des coûts de fonctionnement élevés. Outre leur coût initial élevé et leur consommation de gaz, l'équilibrage et l'entretien des chambres communes d'hypoxie nécessitent un maintien de l'atmosphère hypoxique constante contre le gradient de gaz qui se produit naturellement dans ces chambres en raison de leur plus grande taille et / ou de leur respiration. Cela nécessite l'emploi de ventilateurs à gaz et un système de refroidissement, ce qui augmente la quantité d'équipement nécessaire supplémentaire, entrave la dextérité du chercheur et diminue globalement la simplicité de la procédure expérimentale. En revanche, la configuration que nous présentons ici est relativement robuste mais très rentable, petite, facile à établir et permet fÉquilibre économique des gaz, atmosphère hypoxique stable et échange simple de matériaux et de solutions dans la chambre. Notre système peut être utilisé pour être utilisé avec n'importe quel organisme modèle aquatique d'intérêt.

Nous avons construit une chambre hypoxique qui est commodément petite et donc peut être placée dans un incubateur de laboratoire commun, ce qui permet facilement des procédures expérimentales à n'importe quelle température spécifique. Offrant un contrôle pratique de la température ainsi que de la concentration d'oxygène dans le milieu, l'avantage de notre système contre les incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce réside dans sa petite taille et son rapport coût-efficacité. Ainsi, notre configuration peut être établie en utilisant des fournitures de laboratoire générales disponibles pour la majorité des laboratoires de recherche et ne nécessite aucun matériau coûteux. En outre, notre installation ne génère pas de chaleur, contrairement aux incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce, et permet une utilisation à des températures inférieures à la température ambiante placées dans un incubateur. La laSt est particulièrement critique pour le travail avec des organismes à sang froid tels que les grenouilles et les poissons où les taux de développement et métabolisme dépendent fortement de la température.

Étant très rentable et facilement construit, notre chambre d'incubation de gaz est néanmoins très polyvalente dans l'établissement de diverses conditions hypoxiques ou hyperoxiques, tout en permettant une administration rapide et facile de différents supports et solutions pour un grand nombre de conditions expérimentales. En outre, en utilisant une plaque de 24 puits au lieu des plats couramment utilisés ou des réservoirs de laboratoire 10 , 11 , 12 , notre système permet l'observation et le traitement expérimental de plusieurs conditions mutantes à la fois.

Pour contrôler l'induction correcte de l'hypoxie, nous avons surveillé les niveaux de la protéine HIF-1α par détection Western Blot. En outre, le nombre de cellules proliférantes avant et après incubationN dans la chambre hypoxique peut être utilisé pour déterminer si l'hypoxie a été induite dans le tissu. Cette méthode est basée sur nos résultats précédemment publiés 13 , montrant que la prolifération du nerf embryonnaire de cellules souches rétiniennes diminue lors de l'induction de l'hypoxie. Ainsi, nous avons surveillé le niveau de prolifération des cellules souches de la rétine en ajoutant de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) au milieu embryonnaire et en mesurant son incorporation dans l'ADN des cellules nouvellement proliférantes.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices sur les soins des animaux de l'Université de Cambridge. 1. Entretien des animaux Embryons de grenouille REMARQUE: Les embryons peuvent être élevés et entretenus selon les installations animales et de laboratoire. Ici, un exemple de maintenance animale est décrit. Préparer une solution de solution Barth Solution (MBS) de 0,1 x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO 3 24 u, HEPES 100 uM, MgS04 8,2 μM, Ca (NO 3<…

Representative Results

L'utilisation du système de chambre hypoxique que nous présentons ici permet d'étudier les effets de l'hypoxie individuellement et in vivo chez les animaux vivants entiers. L'hypoxie peut être induite en plaçant des embryons entiers de grenouille ou de poisson zèbre dans la chambre hypoxique ( figure 1 ), et être entrepris sur différentes combinaisons de conditions. Une image de notre configuration complète de la chambre à …

Discussion

Ici, nous avons présenté une nouvelle méthode simple mais robuste pour induire une hypoxie qui est ajustée pour être utilisée avec des embruns de grenouille et de poisson zèbre mais peut également être adaptée à d'autres organismes aquatiques. L'avantage majeur de cette méthode réside dans sa simplicité et sa rentabilité. Néanmoins, les résultats obtenus avec cette méthode sont très robustes. Nous avons montré que l'hypoxie peut être efficacement induite dans la chambre à la fois dans d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le soutien de Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z à WAH et la bourse DFG KH 376 / 1-1 décerné à HK

Materials

Sodium chloride Sigma S7653 NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride Sigma P9333 KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES Sigma H3375 0.1X MBS
Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate Sigma 202967 Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma CG10 frog fertilization
Zebrafish breeding tank Carolina 161937 gas chamber construction
24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D for embryo transfer
MS222  Sigma Aldrich E10521-50G embryo anesthetic
RIPA buffer  Sigma R0278-50ML tissue homogenization
Protease inhibitor Sigma P8340 tissue homogenization
Tris Sigma 77-86-1 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol Sigma G5516 4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L3771 SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4X Laemmli loading buffer
Trizma base  Sigma 77-86-1 5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine Sigma G8898 5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
Tween 20 Sigma P2287-500ML 10X TBST
skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 tissue homogenization
pellet pestles Sigma Z359947-100EA tissue homogenization
precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline Oxoid BR0014G 1X PBS
Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
Heat-inactivated Goat Serum Sigma G6767-100ml HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide Molecular Probes C10338 DMSO, EdU incorporation
glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
FluorSave Calbiochem D00170200 mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

References

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Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

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