Summary

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Published: June 26, 2017
doi:

Summary

Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.

Abstract

Aqui, apresentamos um novo sistema de indução de hipoxia, que desenvolvemos para estudar os efeitos da hipóxia em organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema compreende uma câmara com uma configuração simples que, no entanto, é robusta para induzir e manter uma concentração específica de oxigênio e temperatura em qualquer solução experimental de escolha. O sistema apresentado é muito econômico, mas altamente funcional, permite a indução e sustentação da hipoxia para experiências diretas in vivo e por vários períodos de tempo até 48 h.

Para monitorar e estudar os efeitos da hipóxia, empregamos dois métodos – aferição de níveis de fator 1alpha (HIF-1α) induzível por hipoxia em embriões inteiros ou tecidos específicos e determinação da proliferação de células estaminais da retina por 5-etinil-2'- Incorporação de desoxiuridina (EdU) no DNA. Os níveis de HIF-1α podem servir como marcador de hipoxia geral em todo o embrião ou tecidoDe escolha, aqui retina embrionária. A incorporação de EdU nas células de proliferação da retina embrionária é uma produção específica de indução de hipoxia. Assim, mostramos que os progenitores de retina embrionária hipóxica diminuem a proliferação dentro de 1 h de incubação sob 5% de oxigênio de embriões de sapo e zebrafish.

Uma vez dominado, nossa configuração pode ser empregada para uso com pequenos organismos modelo aquáticos, para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob concentração de oxigênio normal, hipóxica ou hiperóxica ou sob qualquer outra mistura de gás.

Introduction

A pesquisa de hipoxia tem inúmeras aplicações. Estes incluem a investigação da patogênese e o desenvolvimento de tratamentos para condições médicas caracterizadas por hipoxia 1 e doença aguda de alta altitude 2 . O estresse hipóxico causa grandes alterações metabólicas em todos os organismos que necessitam de oxigênio. O estresse hipóxico também influencia o crescimento e desenvolvimento fetal e a patogênese de várias doenças humanas, incluindo a restrição do crescimento intra-uterino 3 . O estresse hipoxico não só pode levar a um menor peso ao nascer, mortalidade fetal e neonatal, mas também pode resultar em muitas complicações na vida adulta, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão 4 . O estresse hipóxico também é freqüentemente observado durante o desenvolvimento de tumor sólido, quando o tecido tumoral ultrapassa o suprimento de sangue. Por conseguinte, é crucial poder estudar os efeitos da hipóxia in vivo e directamente durante o embrião Desenvolvimento yônico.

Entre os métodos mais bem conhecidos que foram empregados para estudar os efeitos da hipoxia durante o desenvolvimento é o uso de cloreto de cobalto no meio de crescimento ou a incubação do organismo em uma câmara hipóxica. O cloreto de cobalto induz artificialmente uma resposta hipóxica sob a concentração normal de oxigênio, devido ao seu papel na estabilização do alfa de factor 1 induzível pela hipoxia (HIF-1a), prevenindo sua degradação proteossômica 5 , 6 , 7 . No entanto, sendo um método conveniente 8 , o uso de cloreto de cobalto, bem como outros miméticos de hipóxia química semelhantes, podem ter efeito deletério inespecífico sobre células e tecidos, por exemplo , apoptose 9 . Portanto, as câmaras hipóxicas são um método melhor para a indução de "hipoxia natural" em organismos vivos ao longo do desenvolvimento normal.

Nós nos concentramos no desenvolvimento de um sistema de indução de hipoxia em embriões de animais aquáticos, tanto os sapos quanto o peixe-zebra tornaram-se organismos modelo informativos de vertebrados para estudos de numerosos processos biológicos, bem como modelos para várias doenças humanas. Embriões de sapo e zebra Desenvolver externamente, eliminando a complicação da compensação materna. Além disso, um rápido processo de desenvolvimento permite manipular fatores ambientais e observar as mudanças fenotípicas na formação de órgãos em tempo real. Além disso, muitos componentes das principais direções de transdução de sinal são altamente conservados em Esses organismos modelo e foram caracterizados em detalhes por uma grande quantidade de literatura. A principal vantagem no uso de sapos e embriões de peixe-zebra para estudar os efeitos da hipóxia no desenvolvimento de vertebrados é que todos os processos podem ser monitorados diretamente, já que o oxigênio penetra rapidamente nos embriões. Assim, em sapos e peixe-zebra, como em contraste com outros organismos modelo, comoEmbriões de camundongo, a influência de uma concentração específica de oxigênio pode ser estudada no tecido de interesse, sem levar em consideração a presença ou falta de vasculatura funcional.

A maioria das configurações comercialmente disponíveis para incubação hipóxica tem a desvantagem de ser comparativamente grande e ter custos de funcionamento correspondentemente elevados. Além de seu alto custo inicial e consumo de gás, equilíbrio e manutenção de câmaras de hipoxia comuns requer manutenção de atmosfera hipoxica constante contra o gradiente de gás que ocorre naturalmente nestas câmaras devido ao seu maior tamanho e / ou respiração do organismo. Isso requer emprego de ventiladores de gás e um sistema de resfriamento, o que aumenta a quantidade de equipamentos necessários adicionais, impede a destreza do pesquisador e diminui a simplicidade do procedimento experimental. Em contraste, a configuração que apresentamos aqui é comparativamente robusta, mas muito econômica, pequena, fácil de estabelecer e permite que fEquilíbrio de gás, atmosfera hipóxica estável e troca simples de materiais e soluções dentro da câmara. Nosso sistema pode ser empregado para uso com qualquer organismo modelo aquático de interesse.

Nós construímos uma câmara hipóxica que é convenientemente pequena e, portanto, pode ser colocada dentro de uma incubadora comum de laboratório, que permite facilmente procedimentos experimentais a qualquer temperatura específica. Fornecer um controle conveniente da temperatura, bem como a concentração de oxigênio no meio, a vantagem do nosso sistema contra as incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis reside no seu pequeno tamanho e eficiência de custos. Assim, nossa configuração pode ser estabelecida usando suprimentos laboratoriais gerais disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa e não exige materiais caros. Além disso, nossa configuração não gera calor, ao contrário das incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis, e permite o uso a temperaturas inferiores à temperatura ambiente colocadas em uma incubadora. A laSt é especialmente crítico para o trabalho com organismos de sangue frio, como sapos e peixes, onde as taxas de desenvolvimento e metabólicas são fortemente dependentes da temperatura.

Sendo muito rentável e facilmente construído, a nossa câmara de incubação de gás é, no entanto, muito versátil no estabelecimento de várias condições hipóxicas ou hiperóxicas, além de permitir uma administração rápida e fácil de diferentes meios e soluções para uma grande quantidade de condições experimentais. Além disso, empregando uma placa de 24 poços em vez de pratos comumente usados ​​ou tanques de laboratório 10 , 11 , 12 , nosso sistema permite a observação e tratamento experimental de várias condições mutantes ao mesmo tempo.

Para controlar a indução correta de hipoxia, monitoramos os níveis da proteína HIF-1a por detecção de Western Blot. Além disso, o número de células que proliferam antes e depois da incubaçãoN na câmara hipóxica pode ser usado para determinar se a hipóxia foi induzida no tecido. Este método baseia-se nos resultados publicados anteriormente 13 , mostrando que a proliferação no nicho das células-tronco da retina embrionária diminui após a indução da hipoxia. Assim, monitorizamos o nível de proliferação de células estaminais da retina por adição de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) ao meio embrionário e medindo sua incorporação no DNA de células que proliferam recentemente.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cambridge. 1. Manutenção de animais Embriões de sapo NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito. Preparar solução de solução Barth's Solution (MBS) de 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO3 24 uM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 , 3,3 μM e CaCl2 a 4,1 u…

Representative Results

Empregar o sistema de câmara hipoxica que apresentamos aqui permite o estudo dos efeitos da hipoxia individual e in vivo em animais vivos inteiros. A hipoxia pode ser induzida colocando embriões inteiros de sapo ou zebra na câmara hipóxica ( Figura 1 ), e deve ser realizada em diferentes combinações de condições. Uma imagem da nossa configuração completa da câmara de gás é mostrada na Figura 2 . Nós monito…

Discussion

Aqui apresentamos um novo método fácil, mas robusto, para induzir hipoxia que é ajustada para uso com embriões de sapo e zebra, mas também pode ser adequada para outros organismos aquáticos. A principal vantagem deste método reside na sua simplicidade e eficiência de custos. No entanto, os resultados obtidos com este método são muito robustos. Mostramos que a hipoxia pode ser induzida eficientemente na câmara tanto em embriões inteiros quanto em tecido específico – aqui, retinas. Para determinar a eficácia…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo apoio do Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e a bolsa DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK

Materials

Sodium chloride Sigma S7653 NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride Sigma P9333 KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES Sigma H3375 0.1X MBS
Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate Sigma 202967 Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma CG10 frog fertilization
Zebrafish breeding tank Carolina 161937 gas chamber construction
24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D for embryo transfer
MS222  Sigma Aldrich E10521-50G embryo anesthetic
RIPA buffer  Sigma R0278-50ML tissue homogenization
Protease inhibitor Sigma P8340 tissue homogenization
Tris Sigma 77-86-1 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol Sigma G5516 4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L3771 SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4X Laemmli loading buffer
Trizma base  Sigma 77-86-1 5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine Sigma G8898 5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
Tween 20 Sigma P2287-500ML 10X TBST
skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 tissue homogenization
pellet pestles Sigma Z359947-100EA tissue homogenization
precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline Oxoid BR0014G 1X PBS
Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
Heat-inactivated Goat Serum Sigma G6767-100ml HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide Molecular Probes C10338 DMSO, EdU incorporation
glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
FluorSave Calbiochem D00170200 mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

References

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Cite This Article
Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

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