Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Hypoxie-Forschung hat zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören die Untersuchung der Pathogenese und die Entwicklung von Behandlungen für medizinische Zustände, die durch Hypoxie ¹ und akute Höhenkrankheit gekennzeichnet sind ² . Hypoxischer Stress verursacht große metabolische Veränderungen in allen Organismen, die Sauerstoff benötigen. Hypoxischer Stress beeinflusst auch das fetale Wachstum und die Entwicklung und die Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten, einschließlich der intrauterinen Wachstumsbeschränkung ³ . Hypoxischer Stress kann nicht nur zu reduziertem Geburtsgewicht, fetaler und neonataler Mortalität führen, sondern kann auch zu vielen Komplikationen im Erwachsenenleben führen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Fettleibigkeit und Hypertonie ⁴ . Ein hypoxischer Stress wird auch häufig während der soliden Tumorentwicklung beobachtet, wenn das Tumorgewebe seine Blutversorgung erweitert. Es ist daher entscheidend, die Auswirkungen von Hypoxie in vivo und direkt während der Embr Yonische Entwicklung.

Unter den bekanntesten Methoden, die zur Untersuchung von Wirkungen von Hypoxie während der Entwicklung angewendet wurden, ist die Verwendung von Kobaltchlorid im Wachstumsmedium oder die Inkubation des Organismus in einer hypoxischen Kammer. Kobaltchlorid induziert aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung von hypoxieinduzierbarem Faktor-1 alpha (HIF-1α) durch die Verhinderung seines proteosomalen Abbaus ^{5 , 6 , 7} künstlich eine hypoxische Reaktion unter normaler Sauerstoffkonzentration. Allerdings kann die Verwendung von Cobaltchlorid sowie anderer ähnlicher chemischer Hypoxie-Mimetika eine unspezifische schädliche Wirkung auf Zellen und Gewebe, z . B. Apoptose ^{9, aufweisen} . Daher sind hypoxische Kammern eine bessere Methode zur Induktion von "natürlicher Hypoxie" in lebenden Organismen durch den Verlauf der normalen Entwicklung.

Wir haben uns auf die Entwicklung eines Systems zur Induktion von Hypoxie in Wassertierembryonen konzentriert. Beide Frösche und Zebrafisch sind mittlerweile zu informativen Wirbeltiermodellorganismen für Studien zahlreicher biologischer Prozesse sowie zu Modellen für verschiedene menschliche Krankheiten geworden. Frosch- und Zebrafisch-Embryonen Entwickeln sich nach außen, eliminieren die Komplikation der mütterlichen Kompensation, und ein schneller Entwicklungsverlauf ermöglicht es, Umweltfaktoren zu manipulieren und die phänotypischen Veränderungen der Organbildung in Echtzeit zu beobachten. Darüber hinaus sind viele Komponenten großer Signaltransduktionswege in hohem Maße konserviert Diese Modellorganismen sind im Detail durch eine große Anzahl von Literatur charakterisiert worden. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Fröschen und Zebrafisch-Embryonen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf die Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, ist, dass alle Prozesse direkt überwacht werden können, da Sauerstoff schnell die Embryonen durchdringt. So, bei Fröschen und Zebrafisch, wie im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wieMaus-Embryonen, kann der Einfluss einer spezifischen Sauerstoffkonzentration im interessierenden Gewebe untersucht werden, ohne die Anwesenheit oder den Mangel an funktionellem Gefäß zu berücksichtigen.

Die meisten handelsüblichen Aufbauten für die hypoxische Inkubation haben den Nachteil, dass sie vergleichsweise groß sind und entsprechend hohe Betriebskosten aufweisen. Abgesehen von ihrem hohen anfänglichen Kosten- und Gasverbrauch erfordert die Äquilibrierung und die Aufrechterhaltung gemeinsamer Hypoxie-Kammern die Aufrechterhaltung einer konstanten hypoxischen Atmosphäre gegen den Gasgradienten, der in diesen Kammern aufgrund ihrer größeren und / oder organischen Atmung natürlich vorkommt. Dies erfordert die Verwendung von Gasventilatoren und ein Kühlsystem, das die Menge an zusätzlichen notwendigen Geräten erhöht, die Geschicklichkeit des Forschers beeinträchtigt und insgesamt die Einfachheit des experimentellen Verfahrens verringert. Im Gegensatz dazu ist das hier präsentierte Setup vergleichsweise robust, aber sehr kostengünstig, klein, einfach zu ermitteln und erlaubt fAst Gas-Äquilibrierung, stabile hypoxische Atmosphäre und einfacher Austausch von Materialien und Lösungen in der Kammer. Unser System kann für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell Organismus von Interesse eingesetzt werden.

Wir haben eine hypoxische Kammer konstruiert, die bequem klein ist und daher in einem gemeinsamen Laborinkubator platziert werden kann, was leicht experimentelle Eingriffe bei einer bestimmten Temperatur ermöglicht. Durch die bequeme Kontrolle der Temperatur sowie der Sauerstoffkonzentration im Medium liegt der Vorteil unseres Systems gegenüber den handelsüblichen Hypoxieinkubatoren in seiner geringen Größe und Kosteneffizienz. So kann unser Setup mit Hilfe von Laboratorien für die meisten Laboratorien eingerichtet werden und erfordert keine teuren Materialien. Darüber hinaus erzeugt unser Setup keine Hitze, im Gegensatz zu den handelsüblichen Hypoxie-Inkubatoren und ermöglicht die Verwendung bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur in einem Inkubator. Das laSt ist besonders kritisch für die Arbeit mit kaltblütigen Organismen wie Frösche und Fische, wo Entwicklungs- und Stoffwechselraten stark temperaturabhängig sind.

Als sehr kostengünstig und leicht zu bauen ist unsere Gasinkubationskammer dennoch sehr vielseitig einsetzbar, um verschiedene hypoxische oder hyperoxische Zustände zu etablieren und eine schnelle und einfache Verabreichung unterschiedlicher Medien und Lösungen für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht unser System die Verwendung einer 24-Well-Platte anstelle von üblicherweise verwendeten Speisen oder Labortanks ^{10 , 11 , 12.} Unser System ermöglicht die Beobachtung und experimentelle Behandlung von mehreren Mutantenbedingungen auf einmal.

Um die korrekte Induktion der Hypoxie zu kontrollieren, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins durch Western-Blot-Detektion überwacht. Darüber hinaus ist die Anzahl der proliferierenden Zellen vor und nach der InkubationN in der hypoxischen Kammer kann verwendet werden, um festzustellen, ob Hypoxie im Gewebe induziert worden ist. Diese Methode basiert auf unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen ¹³ , die zeigen, dass die Proliferation in der embryonalen retinalen Stammzellnische bei der Induktion der Hypoxie abnimmt. So haben wir das Niveau der Retinal-Stammzell-Proliferation durch Zugabe von 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) zum Embryonemedium überwacht und deren Einarbeitung in die DNA von neu proliferierenden Zellen gemessen.