Summary

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em> In Vitro</em> Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la vigilancia inmune. alteraciones relacionadas con la enfermedad de extravasación de linfocitos podrían dar lugar a cambios fisiopatológicos en el SNC. Por lo tanto, la investigación de la migración de linfocitos en el SNC es importante entender las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y para desarrollar nuevos enfoques de terapia. Aquí presentamos un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro humano para estudiar la extravasación de linfocitos. células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) se cultivan confluently en un tereftalato de polietileno poroso transwell insertar para imitar el endotelio de la barrera sangre-cerebro. La función de barrera es validado por zonula occludens inmunohistoquímica, la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) mediciones así como el análisis de evans permeación azul. Este modelo permite la investigación de la diapedesis de los subgrupos de linfocitos raros tales como CD56 CD16 brillante dim / – las células NK. Ademmineral, los efectos de otras células, citocinas y quimiocinas, alteraciones relacionadas con la enfermedad, y regímenes de tratamiento distintos sobre la capacidad migratoria de los linfocitos puede ser estudiado. Por último, el impacto de los estímulos inflamatorios, así como diferentes regímenes de tratamiento en la barrera endotelial pueden ser analizados.

Introduction

la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos es crucial para la vigilancia inmune. Una secuencia de interacciones moleculares específicas asegura sitio extravasación específico en el intestino delgado, piel, ganglios linfáticos, el sistema nervioso central (SNC), y otros tejidos 1. Las alteraciones en la migración de linfocitos están implicados en la fisiopatología de una serie de enfermedades de amplia difusión 2. Migración en la inmuno-privilegiado CNS está estrechamente regulada y, en consecuencia alteraciones de este proceso están involucrados en las enfermedades relacionadas con el SNC como la encefalomielitis 3, neuromielitis óptica, derrame cerebral y la esclerosis múltiple (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Por lo tanto, es importante estudiar la extravasación de linfocitos para entender mejor la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de herramientas para una mejoramiento del terreno de carga 8, 9, 10, 11, 12 enfermedad.

Los linfocitos migran al SNC a través de rutas distintas. La extravasación a través de las vénulas postcapilares en el espacio subaracnoideo a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo dentro del plexo coroideo y través de la barrera sangre-cerebro se han descrito 1, 13, 14, 15. La migración a través de la barrera sangre-cerebro se lleva a cabo por la interacción de los linfocitos con las células endoteliales 14. En contraste a las células endoteliales en la periferia, las células endoteliales de la CNS expresan altas cantidades de moléculas de unión estrecha, con lo estrictamente limitando la cantidad de células y proteínas capaces de cruzar la barrera sangre-cerebrolass = "xref"> 16. resultados inflamación en el aflojamiento de las uniones estrechas e induce la expresión de moléculas de adhesión; por lo tanto, la mejora de la migración de linfocitos en el SNC 1, 17, 18.

La extravasación a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Linfocitos de sujeción para las células endoteliales y luego rodar a lo largo del endotelio en un proceso mediado principalmente por las selectinas 1, 15. Posteriormente, las interacciones entre las quimiocinas secretadas por el endotelio y los respectivos receptores de quimioquinas expresados en los linfocitos inducen cambios conformacionales de las integrinas, promoviendo así la adhesión firme a las células endoteliales 1. Finalmente, los linfocitos o bien arrastre a lo largo de la barrera endotelial contra el flujo de sangre antes de transmigrando en el espacio perivascular, o detener inmediatamente y directamente transmigrate en el sitio de la firma de la adhesión 1, 19, 20. Todos estos pasos de extravasación de linfocitos pueden ser analizados in vitro usando técnicas distintas 21. Time-lapse microscopía de vídeo se utiliza para estudiar la inmovilización inicial y 15 de rodamiento. Ensayos de adhesión proporcionan información detallada acerca de la detención firme endoteliales barreras 22. Ensayos de transmigración como se demuestra aquí permiten el análisis de la transmigración de células inmune 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Uso de la humana en sangre modelo in vitro de barrera cerebro, recientemente hemos podido demostrar que un Migr mayorcapacidad Atory de CD56 CD16 brillante dim / – células NK en comparación con su CD56 dim CD16 + homólogos se reflejó por un predominio de este subconjunto de células NK en el compartimento intratecal 21. Por lo tanto, nuestra configuración experimental parece ser adecuado para imitar la situación in vivo.

Protocol

1. Cultivo celular de cerebro humano Las células endoteliales microvasculares (HBMEC) Recubrimiento de matraces de cultivo celular Para preparar la solución de fibronectina, añadir 10 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 150! L fibronectina y mezclar bien. Para cubrir la parte inferior de un frasco de cultivo de células T-25 Añadir 2 ml de la solución de fibronectina. Incubar el matraz de cultivo de células durante al menos 3 h a 37 ° C en la incubadora. Matraces rec…

Representative Results

Se muestran los resultados representativos que muestran transmigración de las células NK y subconjuntos de células T utilizando el hematoencefálica modelo de barrera humana (Figura 1A). La integridad de la monocapa HBMEC fue validado por tinción de la molécula de unión estrecha mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ZO-1, y evans permeación azul (Figura 1B). Después de 3 – 4 días de cultivo HBMEC expresa la molécula de uni…

Discussion

Aquí presentamos una técnica para investigar la transmigración de los linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro humano. El análisis in vitro de la migración de linfocitos al SNC es importante para estudiar los procesos básicos de la extravasación de linfocitos, posibles alteraciones relacionadas con la enfermedad, y los nuevos enfoques terapéuticos.

Varias modificaciones del modelo de barrera hematoencefálica son posibles. Por ejemplo, las células del comp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

Materials

PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

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