Summary

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em> במבחנה</em> דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

extravasation לימפוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי עבור מעקב חיסוני. מחלות הקשורות שינויים של extravasation הלימפוציטים עלול לגרום לשינויים פתופיזיולוגיים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, החקירה של הגירה לימפוציטים לתוך CNS חשוב להבין מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ועל מנת לפתח גישות טיפול חדשות. כאן אנו מציגים מודל במבחנה של מחסום דם-מוח האדם ללמוד extravasation הלימפוציטים. המוח כלי הדם אנוש תאי אנדותל (HBMEC) גדלים confluently על terephthalate פוליאתילן נקבובי Transwell להכניס לחקות האנדותל של מחסום הדם-מוח. תפקוד המחסום אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה occludens zonula, ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) מדידות כמו גם ניתוח של חלחול כחול אוונס. מודל זה מאפשר חקירה של diapedesis של תת הלימפוציטים נדירים כגון CD16 בהיר CD56 לעמעם / – תאי NK. Furthermעפרות, את ההשפעות של תאים אחרים, ציטוקינים chemokines, שינויים הקשורים למחלות, ועל משטרי טיפול מובחנים על יכולת הנדידה של לימפוציטים ניתן ללמוד. לבסוף, את ההשפעה של גירויים דלקתיים כמו גם משטרי טיפול שונים על מחסום אנדותל ניתן לנתח.

Introduction

הגירה לימפוציטים מהדם אל רקמות היא קריטית עבור מעקב חיסוני. רצף של אינטראקציות מולקולריות ספציפיות מבטיח extravasation באתר מסוים לתוך מעי דק, עור, בלוטות לימפה, מערכת העצבים המרכזית (CNS), ורקמות אחרות 1. שינויים הגירה לימפוציטים מעורבים בפתופיזיולוגיה של מספר מחלות פרושות לרווחה 2. הגירה אל החיסונית-חסוי CNS מוסדר בחוזקה ושינויים בהתאם התהליך הזה מעורבים במחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית כמו encephalomyelitis 3, neuromyelitis אופטיקה, שבץ, טרשת נפוצה (MS) 2, 4, 5, 6, 7. לכן, חשוב ללמוד extravasation הלימפוציטים להבין טוב יותר פתופיזיולוגיה המחלה ולפתח כלים עבור צמחים וטיוב של מחלה 8 ניטל, 9, 10, 11, 12.

לימפוציטים להגר לתוך CNS באמצעות מסלולים נפרדים. Extravasation דרך venules postcapillary לחלל תת-עכבישי דרך מחסום נוזל המוח והשדרה-דם בתוך מקלעת דמית ולרוחב את מחסום הדם-מוח תוארו 1, 13, 14, 15. הגירה דרך מחסום הדם-מוח מתבצעת על ידי האינטראקציה של לימפוציטים עם תאי אנדותל 14. בניגוד לתאי אנדותל בפריפריה, תאי אנדותל של CNS לבטא כמויות גבוהות של מולקולות צומת חזק, ובכך בהחלט להגביל את כמות התאים והחלבונים מסוגל לחצות את מחסום הדם-מוחנַעֲרָה = "Xref"> 16. תוצאות דלקת התרופפות של צמתים הדוקים ומשרה את הביטוי של מולקולות הדבקה; ובכך, שיפור הגירה לימפוציטים לתוך CNS 1, 17, 18.

Extravasation דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. לימפוציטים לקשור את תאי האנדותל ואז לגלגל לאורך האנדותל בתהליך בתיווך בעיקר על ידי selectins 1, 15. לאחר מכן, אינטראקציות בין וכמוקינים מופרשים על ידי האנדותל ואת קולטני chemokine בהתאמה הביעו על לימפוציטים לגרום לשינויים קונפורמציה של integrins, ובכך לקדם הדבקת חברת אל תאי אנדותל 1. לבסוף, לימפוציטים או זחילה לאורך המכשול אנדותל נגד זרימת הדם לפני transmigrating לחלל perivascular, או לעכב באופן מיידי וישיר Transmigrate באתר של הדבקת חברת 1, 19, 20. כל הצעדים הללו של extravasation הלימפוציטים ניתן לנתח במבחנה באמצעות טכניקות ברורות 21. זמן לשגות מיקרוסקופ וידאו משמש ללמוד את הקשירה הראשונית מתגלגל 15. מבחני הדבקה לספק מידע מפורט על מעצרו משרד אנדותל מחסומים 22. מבחני גלגול נשמות, כפי שהודגם כאן מאפשרים ניתוח של גלגול חיסוני תאים 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

שימוש האנושי במודל מחסום דם המוח במבחנה, אנו לאחרונה יכולים להראות כי migr גבוהקיבולת atory של CD16 הבהיר CD56 לעמעם / – תאי NK לעומת CD56 שלהם עמום CD16 + עמיתיהם שהתבטאו דומיננטיות של תת תא זה NK בתא intrathecal 21. לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו נראה מתאים לחקות את המצב vivo.

Protocol

1. Cell תרבות לתאי אנדותל כלי הדם המוח האנושי (HBMEC) ציפוי של צלוחיות תרבית תאים כדי להכין את הפתרון פיברונקטין, להוסיף 10 מ"ל PBS כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. הוספת 150 μL פיב?…

Representative Results

תוצאות נציג מראה גלגול NK-התא תת T תאים בעזרת מודל מחסום הדם-מוח אנושי (איור 1 א) מוצגים. היושרה של monolayer HBMEC תוקף של הכתמה של המולקולה בצומת דוק ZO-1, התנגדות חשמלית Transendothelial (TEER) מדידות, וכן חלחול הכחול אוונס (איור 1B). בעקבות 3 – 4 ימי התרבות…

Discussion

כאן אנו מציגים טכניקה לחקור גלגול לימפוציטים פני מחסום דם-המוח האנושי. בניתוח חוץ גופית של הגירה לימפוציטים אל CNS חשוב ללמוד תהליכים בסיסיים של extravasation הלימפוציטים, שינויים מחלות הקשורות פוטנציאל, גישות טיפוליות חדשות.

שינו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

Materials

PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Play Video

Cite This Article
Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

View Video