Summary

Analyse des Lymphocytes extravasation L'utilisation d'un<em> In vitro</em> Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

Lymphocyte extravasation dans le système nerveux central (SNC) est essentiel pour la surveillance immunitaire. altérations liés à la maladie de l'extravasation des lymphocytes pourraient entraîner des changements physiopathologiques du système nerveux central. Ainsi, l'enquête sur la migration des lymphocytes dans le système nerveux central est important de comprendre les maladies inflammatoires du système nerveux central et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous présentons ici un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau humain pour étudier extravasation des lymphocytes. les cellules endotheliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) sont cultivées confluente sur un téréphtalate de polyéthylène poreux Transwell insérer pour imiter l'endothélium de la barrière hémato-encéphalique. Fonction de barrière est validée par l'immunohistochimie de zonula, des mesures de résistance électrique (TEER) transendothéliale ainsi que l'analyse de permeation bleu Evans. Ce modèle permet d' étudier la diapédèse des sous – ensembles de lymphocytes rares tels que CD56 CD16 lumineux dim / – cellules NK. e plusle minerai, les effets d'autres cellules, des cytokines et des chimiokines, des altérations liées à la maladie, et les schémas thérapeutiques distincts sur la capacité migratoire des lymphocytes peut être étudiée. Enfin, l'impact des stimuli inflammatoires, ainsi que différents régimes de traitement sur la barrière endothéliale peuvent être analysées.

Introduction

la migration des lymphocytes du sang dans les tissus est crucial pour la surveillance immunitaire. Une séquence d'interactions moléculaires spécifiques assure le site extravasation spécifique dans l' intestin grêle, peau, ganglions lymphatiques, le système nerveux central (SNC) et d' autres tissus 1. Les modifications de la migration des lymphocytes sont impliqués dans la physiopathologie d'un certain nombre de maladies largement répandus 2. La migration dans le SNC immuno-privilégié est étroitement régulée , et en conséquence des modifications de ce procédé sont impliqués dans les maladies liées au SNC, comme l' encéphalomyélite 3, la neuromyélite optique, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Il est donc important d'étudier extravasation des lymphocytes pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et de développer des outils pour une mélioration de la charge de morbidité 8, 9, 10, 11, 12.

Les lymphocytes migrent dans le système nerveux central par des voies distinctes. Extravasation à travers veinules post – capillaires dans l'espace sous – arachnoïdien par l' intermédiaire de la barrière de fluide céphalo-sang dans les plexus choroïdes et à travers la barrière sang-cerveau ont été décrits 1, 13, 14, 15. La migration à travers la barrière hémato-encéphalique est réalisée par l'interaction des lymphocytes avec des cellules endotheliales 14. Contrairement aux cellules endotheliales à la périphérie, les cellules endotheliales du système nerveux central expriment de grandes quantités de molécules de jonctions serrées, ce qui limite strictement la quantité de cellules et de protéines capables de traverser la barrière hémato-encéphaliquelass = "xref"> 16. Résultats de l'inflammation dans le desserrage des jonctions serrées et induit l'expression de molécules d'adhésion; Ainsi, l' amélioration de la migration des lymphocytes dans le SNC 1, 17, 18.

Extravasation via la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Lymphocytes attache aux cellules endothéliales et ensuite rouler le long de l'endothélium dans un procédé principalement médiée par les sélectines 1, 15. Par la suite, les interactions entre les chimiokines sécrétées par l'endothélium et les récepteurs de chimiokines respectifs exprimés sur les lymphocytes induisent des changements conformationnels d'intégrines, favorisant ainsi l' adhésion ferme aux cellules endothéliales 1. Enfin, les lymphocytes, soit exploration le long de la barrière endothéliale contre le flux sanguin avant transmigrant dans l'espace périvasculaire, ou bloquer immédiatement et directement transmigrate au niveau du site d'adhérence de la firme 1, 19, 20. Toutes ces étapes de l' extravasation des lymphocytes peuvent être analysés in vitro en utilisant des techniques distinctes 21. La microscopie vidéo time-lapse est utilisé pour étudier la fixation initiale et le laminage 15. Des tests d'adhésion fournissent des informations détaillées sur l' arrestation ferme endothéliale barrières 22. Des dosages de transmigration comme démontré ici permettent l' analyse de la transmigration des cellules immunitaires 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Utilisation de l'humain in vitro modèle de barrière hémato-encéphalique, on pourrait montrer récemment que plus migrla capacité de Atory de CD56 CD16 lumineux dim / – cellules NK par rapport à leur CD56 CD16 + dim homologues est reflété par une prédominance de ce sous – ensemble des cellules NK dans le compartiment 21 intrathécale. Ainsi, notre dispositif expérimental semble être approprié pour simuler la situation in vivo.

Protocol

1. Culture cellulaire des cellules cérébrales microvasculaire endothéliales humaines (HBMEC) Revêtement des flacons de culture cellulaire Pour préparer la solution de fibronectine, ajouter 10 ml de PBS à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 150 pi fibronectine et bien mélanger. Pour couvrir le fond d'un flacon de culture de cellules T-25 ajouter 2 mL de la solution de fibronectine. Incuber le flacon de culture cellulaire pendant au moins 3 h à 37 ° C dans l'incubateur. …

Representative Results

Les résultats représentatifs montrant transmigration des sous – ensembles de cellules NK et de lymphocytes T en utilisant le modèle de barrière sang-cerveau humain (figure 1A) sont représentés. L'intégrité de la monocouche mesures HBMEC a été validé par la coloration de la molécule de jonction étanche ZO-1, transendothéliaux résistance électrique (TEER), et permeation bleu Evans (figure 1B). Suite à 3 – 4 jours de culture HBMEC a exp…

Discussion

Nous présentons ici une technique pour étudier la transmigration des lymphocytes à travers la barrière sang-cerveau humain. L'analyse in vitro de la migration des lymphocytes au système nerveux central est important d'étudier les processus de base de l' extravasation des lymphocytes, des altérations liées aux maladies potentielles, et de nouvelles approches thérapeutiques.

Plusieurs modifications du modèle de barrière hémato-encéphalique sont possibles. Par …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

Materials

PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

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