Summary

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Published: December 23, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Abstract

Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine ​​einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.

Introduction

Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, 1 mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. 1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, 4 Azid, 5 Alkin, 6 Cyclooctin, 7 Tetrazin, 8 α, β-ungesättigten Amids, 9 Norbonen, 10 transcyclooctene, 11 und Bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Obwohl jede funktionelle Gruppe ihre Vor- und Nachteile hat, die azidhaltigen Aminosäuren am intensivsten wurden für die Protein Konjugation verwendet. p -Azidophenylalanine (AF), eine der Azido-enthaltenden Aminosäuren, ist leicht verfügbar, und ihre Inkorporation efficiency ist ausgezeichnet. Mutant Proteine ​​diese Aminosäure enthalten, können mit Alkinen durch Kupfer-katalysierte Cyclo oder mit Cyclooctenen von SPAAC umgesetzt werden. 12-20

In letzter Zeit wurden Biopharmazeutika große Aufmerksamkeit in der pharmazeutischen Industrie zu gewinnen. Der Antikörper-Arzneimittel – Konjugat (ADC) ist eine Klasse von therapeutischen Antikörpern , die aufgrund ihrer Fähigkeit zur gezielten Therapie für die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen 21 vorteilhaft sind und anderen Krankheiten. Mehr als 50 ADCs sind derzeit in klinischen Studien, und die Zahl steigt schnell. In Entwicklung von ADCs, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit zu maximieren und die Nebenwirkungen zu minimieren. Unter diesen Faktoren eine effiziente und stellenspezifische Konjugationsreaktion zu einer kovalenten Bindung zwischen einem Antikörper bilden, und ein Medikament ist kritisch. Die gewünschte Effizienz und Spezifität in der Konjugationsreaktion kann in eine durch Konjugation mit einem bioorthogonale funktionelle Gruppe erreicht werden,unnatürliche Aminosäure, die in einem Antikörper, der spezifisch eingeschlossen ist. Hier 22-26 berichten wir über ein Protokoll zur ortsspezifisch integrieren AF in einem Antikörper-Fragment und konjugieren das mutierte Antikörperfragment mit einer biochemischen Sonde.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel – Antikörper – Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His 6 -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber – Codon (TAG) 27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik. Siehe Tabelle der Materialien. Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte…

Representative Results

In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab w…

Discussion

Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ​​hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. 1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

1. plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1g
LB Broth BD Difco 244620 500g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25g
Agar SAMCHUN 214230 500g
SOC medium Sigma S1797 100ML
3. Expression and purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500ml
3.2 Cell lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1kg
Sucrose Sigma S9378 500g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25ml
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1ml capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10ml
MES running buffer Thermofisher NP0002 500ml
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

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Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

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