Efficace et Antibody Étiquetage par Strain promu Azide-alcyne cycloaddition spécifique du site
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
Il existe actuellement de nombreux outils chimiques disponibles pour introduire des sondes chimiques, dans les protéines à étudier leur structure et leur fonction. Une méthode utile est la protéine par conjugaison génétiquement l'introduction d'un acide aminé non naturel contenant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Ce rapport décrit un protocole détaillé pour l'anticorps conjugaison spécifique au site. Le protocole expérimental comprend les détails de la constitution génétique d'un acide aminé contenant un azoture, et la réaction de conjugaison par cycloaddition de l'azide-alcyne souche promu (SPAAC). Cette réaction de contrainte favorisée par procède par simple mélange des molécules qui réagissent à un pH physiologique et à la température et ne nécessite pas de réactifs supplémentaires tels que le cuivre (I), les ions cuivre et des ligands chélateurs. Par conséquent, cette méthode est utile pour la conjugaison des protéines en général et le développement de conjugués anticorps-médicaments (ADC).
Introduction
Etant donné que la constitution génétique de p -methoxyphenylalanine dans Escherichia coli a été signalé, plus de 1 100 acides aminés non naturels (UAAs) ont été incorporés avec succès dans diverses protéines. 1-3 Parmi ces UAAs, les acides aminés contenant des groupes fonctionnels bioorthogonal ont été largement étudiés et représentent la plus grande proportion. Les groupes fonctionnels utilisés dans les bioorthogonal UAAs comprennent une cétone, un azoture 4, 5 alcyne, 6 cyclooctyne, 7 tétrazine, 8 α, β-insaturé , un amide, un norbornène 9, 10 transcyclooctene, 11 et bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Bien que chaque groupe fonctionnel a ses avantages et ses inconvénients, les acides aminés contenant du azoture ont été le plus largement utilisé pour la protéine conjugaison. p -Azidophenylalanine (AF), l' un des acides aminés contenant azido, est facilement disponible, et son incorporation efficiency est excellent. des protéines mutantes contenant cet acide aminé peut être mis à réagir avec des alcynes par cycloaddition catalysée par le cuivre ou avec cyclooctynes par SPAAC. 12-20
Récemment, biopharmaceutiques ont attiré une grande attention dans l'industrie pharmaceutique. Le conjugué anticorps-médicament (ADC) est une classe d'anticorps thérapeutiques qui sont avantageuses en raison de leur aptitude pour la thérapie ciblée pour le traitement des cancers humains 21 et d'autres maladies. Plus de 50 ADCs sont actuellement en essais cliniques, et le nombre augmente rapidement. Dans le développement de VPA, de nombreux facteurs doivent être considérés pour maximiser l'efficacité et minimiser les effets secondaires. Parmi ces facteurs, la réaction de conjugaison efficace et spécifique de site afin de former une liaison covalente entre un anticorps et d'un médicament est critique. L'efficacité et la spécificité souhaitée dans la réaction de conjugaison peut être obtenue par la conjugaison avec un groupe fonctionnel dans un bioorthogonall'acide aminé non naturel qui est spécifiquement incorporé à un anticorps. 22-26 Ici, nous rapportons un protocole à site spécifiquement incorporer AF dans un fragment d'anticorps et le conjugué fragment d'anticorps mutant avec une sonde biochimique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'incorporation génétique d'acides aminés non naturels dans des protéines présente plusieurs avantages par rapport à d'autres procédés utilisés pour la modification des protéines. 1-3 Un des avantages importants est son applicabilité générale à tout type de protéine. En principe, il n'y a pas de limitation dans la sélection d'une protéine cible et un site cible de la protéine. Toutefois, le remplacement d'un résidu structurellement ou fonctionnellement importante ave…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
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