Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
Ci sono attualmente molti strumenti chimici a disposizione per introdurre sonde chimiche in proteine per studiare la loro struttura e funzione. Un metodo utile è la coniugazione di proteine geneticamente introducendo un amminoacido non naturale contenente un gruppo funzionale bioorthogonal. Questo rapporto descrive un protocollo dettagliato per site-specific anticorpi coniugazione. Il protocollo comprende dettagli sperimentali per la costituzione genetica di un aminoacido azide contenenti, e la reazione di coniugazione per cicloaddizione azide-alchino strain-promosso (SPAAC). Questa reazione strain-promosso procede per semplice miscelazione delle molecole reagenti a pH fisiologico e temperatura, e non richiede reagenti aggiuntivi come rame (I) ioni e leganti rame-chelanti. Pertanto, questo metodo sarebbe utile per la coniugazione di proteine generale e sviluppo di anticorpi coniugati farmaco (ADC).
Introduction
Dal momento che la costituzione genetica di p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli è stato segnalato, 1 più di 100 amminoacidi non naturali (UAAs) sono stati inseriti con successo in varie proteine. 1-3 Tra questi UAAs, gli aminoacidi contenenti gruppi funzionali bioorthogonal sono stati ampiamente studiati e rappresentano la percentuale più elevata. I gruppi funzionali bioorthogonal utilizzati nei UAAs includono chetone, 4 azide, 5 alchino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturo ammide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Sebbene ogni gruppo funzionale ha i suoi vantaggi e svantaggi, gli amminoacidi azide contenenti più sono stati ampiamente utilizzati per la coniugazione di proteine. p -Azidophenylalanine (AF), uno degli amminoacidi azido-contenente, è prontamente disponibile, e la sua incorporazione efficiency è eccellente. proteine mutanti contenenti questo aminoacido può essere fatto reagire con alchini di cicloaddizione di rame-catalizzata o con cyclooctynes di SPAAC. 12-20
Recentemente, biofarmaceutici hanno attratto grande attenzione nel settore farmaceutico. Il coniugato anticorpo-farmaco (ADC) è una classe di anticorpi terapeutici che sono vantaggiosi per la loro capacità di terapia mirata per il trattamento dei tumori umani 21 e altre malattie. Più di 50 ADC sono attualmente in sperimentazione clinica, e il numero è in rapido aumento. Nello sviluppo di ADC, molti fattori devono essere considerati per massimizzare l'efficacia e minimizzare gli effetti collaterali. Tra questi fattori, una reazione di coniugazione efficiente e sito-specifica per formare un legame covalente tra un anticorpo ed un farmaco è critica. L'efficienza desiderata e specificità nella reazione di coniugazione può essere ottenuto mediante coniugazione con un gruppo funzionale in un bioorthogonalamminoacido non naturale che è specificamente incorporata in un anticorpo. 22-26 Qui, si segnala un protocollo al sito-specifico incorporano AF in un frammento di anticorpo e coniugare il frammento di anticorpo mutante con una sonda biochimico.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'incorporazione genetica di aminoacidi non naturali in proteine ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per la modifica della proteina. 1-3 Uno dei vantaggi importanti è la sua applicabilità generale a qualsiasi tipo di proteina. In linea di principio, non vi è alcuna limitazione nella scelta di una proteina bersaglio e un sito target della proteina. Tuttavia, la sostituzione di un residuo strutturalmente o funzionalmente importante con SAU può comportare alterando la struttura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
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