Отложенный роста Анализ ингибирования для количественной оценки влияния бактерий, полученных Противомикробные по конкуренции
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важным шагом этого бактериального протокола видов конкуренции , что отличает его от других, является инкубация в течение ночи ингибитора изолирует перед добавлением конкурента изолята. Штамм ингибитор требует этот период роста производить ингибирующие соединения. По мере того как штамм конкурент накладывается на той же среде, этот метод позволяет исследователю наблюдать весь потенциал штамма ингибитора препятствовать росту штамма конкурента. В результате, этот анализ отражает то, что происходит с природой; один изолят полностью установлена в нише, а другой должен быть в состоянии противодействовать любым ингибирующие переменные, чтобы иметь возможность успешно вторгаются в нишу.
Есть две части к этому протоколу, которые, скорее всего, привести к ошибочным результатам, если выполняется неправильно. Во-первых, неполная стерилизация испарителем бутылки могут ввести загрязняют бактерии в анализе. INCUbation бульона, используемого для ополаскивания бутылки распылительного на этапе 3.6 в стерильный сосуд можно использовать для подтверждения бутылки были полностью стерилизовать. Дополнительные смывки в дезинфицирующих растворов, таких как Virkon, могут быть использованы до промывки в поверхностно-активным чистящее средство, которое, описанного в пункте 3.2, если требуется дополнительной стерилизации.
Второй шаг, который может привести к ошибочным результатам является разбавление штамма конкурента (этап 6.1). Если разбавление не является оптимальным, четкие измерения ингибирования может не быть легко определена. Этот анализ был оптимизирован с помощью различных назальных изолятов в качестве ингибитора штаммы , продуцирующие в широком диапазоне грамположительных и грамотрицательных видов по сравнению с S. стафилококк SH1000 как конкурент штамма 7,8. Впоследствии она была протестирована с использованием различных коагулазонегативные и коагулазную-положительных стафилококков в качестве конкурента и ингибитора штаммов, продуцирующих. При тестировании, кроме описанных выше, в качестве конкурента родовШтамм, некоторые оптимизации разбавления для посевного материала может быть необходимым.
Если ясность оценки существенно различаются между повторами, это может быть необходимо, чтобы стандартизировать конкурент штамма инокулята, установив его к определенной оптической плотности. Тем не менее, это приведет к увеличению времени анализ требуется, чтобы установить, и, вероятно, сократить число штаммов, можно обрабатывать на эксперимент. Визуально регулируя культуру к соответствующему OD с использованием стандарта McFarland может обеспечить быструю альтернативу.
Одним из недостатков этого метода является то, что оно может быть применено только к культивируемых бактерий. Именно поэтому многие исследования используют 16S рРНК последовательности для прогнозирования конкурентного исключения взаимодействий 3,4,13. Тем не менее, генетические и метагеномной методы могут только различать членов сообщества на уровне видов, и / или не учитывают конкретной внутривидовой изменчивости признака. Можно экран для ассоциации с particulген , который кодирует А.Р. черта с наличием или отсутствием видов бактерий 5, однако это требует предварительного знания гена , вероятно, связано с исключением вида.
Безопасна рассмотрение этого метода состоит в том, что, из-за образования аэрозолей бактерий, он может быть использован только в лабораторных условиях с кабинетом безопасности 2, или с подобными мерами безопасности. Есть альтернативные методы тестирования для конкуренции между изолятов, которые составляют внутривидовой изменчивости признака и не производят аэрозоли бактерий. Одним из таких способов является одновременное анализ антагонизма 2. В этом методе, инокулят одного изолята высевали на чашки с агаром, и второй изолят инокулят пятнистый или кололи на вершине, как только первый высох. Это будет производить среду, в которой штаммы находятся в прямой конкуренции (одновременное антагонизм), как конкурирующие с получением ингибирующих соединений и роются питательные вещества, в первую очередь. advantagе отложенного анализа ингибирования роста по сравнению с одновременным анализом антагонизм является то, что ингибитор изолят всегда должен иметь конкурентное преимущество, чтобы быть полностью установлена до вторжения конкурента изолята. Это больше отражает то , что будет происходить в окружающей среде, так как в большинстве ниш, один изолят будет установлен прежде , чем другой штамм добавляется, а не два изолята добавляется в то же время 8.
Другая альтернатива, чтобы избежать аэрозольную поколение бактерий было бы добавить конкурента изолирование верхнего агара, который можно было вылить, а не распыляют над ингибитором изолята. Тем не менее, объем верхнего агара добавляют необходимо будет приблизительно 3 мл, чтобы обеспечить равномерное покрытие пластины. В пределах этого объема, конкурент изолят не будет расти на тех же средствах массовой информации в качестве ингибитора изолята, так что не будет страдать от снижения питательных веществ. Спортсмен также не находиться в непосредственном контакте с любыми тормозными соединениями ЕНТиль они диффундируют в верхнюю агара. Такой анализ не может быть описана как отсроченный ингибирования или одновременного антагонизма.
Аналогичный метод ранее использовался для оценки уровней сопротивления бацитрацинового среди клинических S. стафилококка изолирует 10. Основное различие между протоколом , описанным здесь и который описан 10, является последним только одного объявления конкурента штаммы как чувствительные (полный inhibition- ясность 0 баллов) или устойчивые (частично , чтобы не inhibition- ясности оценка 1-5). Отложенный анализ ингибирования роста также может поэтому быть использован для скрининга уровней сопротивления производителям отдельных противомикробных, или даже для поиска новых антибактериальных препаратов, активных в отношении резистентных патогенов множественной лекарственной устойчивостью.
Было высказано предположение о том , что хост – микрофлора можно манипулировать , чтобы устранить нежелательные члены бактериального сообщества 9. Применение коринебактерий или Staphylococcus эпидермидис уже было показано , чтобы устранить S. стафилококк колонизация в ноздрями в значительной части населения 11,12. Поэтому исследования в конкретных штаммов, которые могут конкурентно исключающих нежелательных членов принимающей флоры, с помощью таких методов, как описана здесь, может привести к будущим терапии.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM финансируется за счет премии BBSRC-МПА с компанией Unilever Plc (BB / L023040 / 1). ППЗ финансируется за счет Аравийского Министерства высшего образования PhD студенчества Саудовской Аравии.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
References
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
