繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

以下の方法は阻害剤産生株で競合他社の株をテストするために7,8を適合されています。 注：このプロトコルは、細菌培養でエアロゾル生成を含みます。これは、ローカルでのみ、承認された安全性を考慮の実装に含まれる空間で実行することができます。レベル2の安全キャビネット内で寒天プレート上に文化の噴霧は寒天プレートと周辺環境の汚染を最小限に抑えることができます。研究者は封じ込めレベル2の生物を使用している場合、これはまた、噴霧菌のエアロゾル吸入から研究者を保護する、これが主要な関心事です。適切な個人保護具を着用する必要があります。ペトリ皿の周囲に最良使い捨て吸収性組織で覆われています。 UV光を用いて、ポストスプレー除染をお勧めします。 1.寒天プレートの準備マヌーに応じて、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天を準備facturerの指示。 、121℃でBHI寒天培地をオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 滅菌ペトリ皿に滅菌BHI寒天15mlのアリコートを注ぎ、それを設定することができます。 注：このアッセイ内で使用するすべての寒天プレートは、寒天の同じ株に由来し、寒天の同じ量を各プレートに存在することを確認してください。これは、利用可能な栄養素と比較を可能にするプレート間の阻害剤拡散の変動を制限します。 2.無菌ブロスの準備します製造元の指示に従ったBHIブロスを準備します。 28ミリリットルのガラスユニバーサルボトルにBHIの10ミリリットルのアリコートを追加します。 、121℃でBHIブロスをオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 注：ブロスAUTの同じバッチに由来するアッセイで使用されているすべてのスープを確認してください結果の変動を引き起こす可能性の栄養素の変動を制限するために、同時にoclaved。 3.準備滅菌気化ボトル（複数可） vapourizerボトルを解体。 一晩5％の界面活性洗浄剤でvapourizerボトル、蓋とvapourizerを浸し、内部汚染物質を除去するためにvapourizerを通して5％の界面活性洗浄剤をスプレーします。 注：界面活性洗浄剤を取り扱う際には手袋と適切な個人保護具を使用する必要があります。 無菌空気流フードの下で気化器、蓋と瓶を乾燥させます。 70％エタノールでボトルを記入し、vapourizerを再接続し、vapourizerを通してエタノールの一部をスプレー。 気化器の蓋を入れて、使用するまで内部のエタノールで保管してください。 使用直前に、無菌的に滅菌BHIブロスでボトルを洗浄し、vapourizerを通して培養液をスプレー。 注：これは、エタノールAFFを防止します6.3節でボトルに加え接種材料をecting。 細菌の一晩培養物（複数可）を準備4 無菌BHI寒天プレート上にストリーク競合他社と阻害剤の株を、約18時間（一晩）好気的に37℃でインキュベートします。 注：このプレートを4℃で保存した場合、同じ週間内の複数の複製のために使用することができる細菌のストックを生成します。 28ミリリットル万能ボトル内の必要な競争相手の細菌株の単一コロニーを滅菌BHIブロスの10ミリリットルを接種します。 オービタルシェーカーで250 rpmで振とうして好気的に37℃で一晩ユニバーサルボトルをインキュベートします。 インヒビター産分離株の5スポット文化セクション4で説明したように一晩培養物（複数可）を準備します。 寒天プレートは蓋の上結露しないと、完全に乾燥していることを確認し、接種前に（PLAをインキュベートすることにより、 例えば37℃で60分間）のためのTE;これは、接種部位から板全体に広がるの接種材料を防ぐことができます。 寒天プレートの中央に一晩培養のピペットを25μl。完全に寒天を横切っ文化をスプレー気泡を防止するために、ピペットプランジャーを押し下げることは避けてください。 文化は文化の広がりを制限するために、室温で乾燥することができます。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。 6.準備テスト他社株のスプレー接種物（複数可） 約4×10 6 CFU ml -1の得るためにBHIブロス中で部4希釈で一晩培養10倍に説明したように一晩培養液を用意し、OD 600 0.3±0.05のサスペンション。 注：10倍希釈は、4×10 6 CFUミリリットルを与えることはありません-1すべての細菌種のために、1×10の間の連続希釈液をメッキ普及により、必要な希釈係数を計算します<s> -1 -1×10 -6アップ。 無菌のプラスチック製の香水の気化器ボトルに希釈した培養を注ぎます。 注：総容積は寒天プレートの数がスプレーされるために必要とされる以上でなければなりません。プレート当たり約250μlを直径9cmのシャーレに適しています。 7.繰延成長阻害アッセイ文化は前寒天上に噴霧するスプレー機構にロードされていることを保証するために、気化器ボトルの各を通じて文化をスプレーしてください。 寒天上記の15cm程度の距離から、全体の寒天表面上に希釈した培養の約250μlの（典型的な50ミリリットル気化器の3スプレー）をスプレー。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。スプレーの同じ番号を持つ他のプレートについて、この手順を繰り返します。 8.繰延成長阻害アッセイの結果の解釈噴霧competiの増殖阻害ゾーンを測定しますタ株（ 図1A – C、「X」「X」へ）（ – C、 "Y"に"Y" 図1A）阻害剤プロデューサーの中心スポットの直径を差し引いミリメートルで、。 メモ： 図1Eは、このデータを提示する方法を示してい阻害ゾーンのための透明度スコアを記録します。 注：これは、観察された阻害の程度を示します。例は、 図1Aに示されている- D、標準化のために使用することができる株は、代表的な結果のセクションで提案されています。以下の規模は、明確化のスコアリングに使用することができます：0の透明度スコアは、競合他社株の成長の完全な阻害のゾーンを記述すること。 1のスコアがクリアのゾーンに存在する唯一の個々のコロニーで、成長のほぼ完全な阻害のゾーンを説明します。 2のスコアが減少し、成長の可視ゾーンを記述するために、このゾーン内の成長は詐欺です流暢またはコンフルエントに近いが、> 50％の密度が縮小されています。 3のスコアは最小限の成長の減少を説明するために、増殖がコンフルエントと50％未満減少し、ゾーンが依然として可視で測定されます。成長の目に見える阻害を記載していないための4つのスコア。 5のスコアは、競合他社の株の増殖が試験阻害剤産生株の近くに増加したことを記述します。例については、 図1を参照してください。これらのスコアは、実験者に主観的です。 9.レプリケート得られた結果の再現性を決定するために、生物学的三重に少なくともアッセイを繰り返します。 注：複製を別の日に行っている場合は、測定を行い、4℃で、その後、インキュベーションから取り出した直後のいずれかのストアプレートをプレートスコアまたはそれらを廃棄する前に、プレートの高品質の写真を撮ります。ストレージまたはプレートの写真は別の日の間の結果の比較が容易に可能になり、トン彼は日/実験全体で再現性の得点を確認するために特に重要です。プレートのストレージが結果を変える可能性を持っていることに注意してください。 注：明確な写真の場所プレートのために直立拡散光の領域でつや消し黒の背景にその蓋なしでは、レンズ（マクロモード）に近いオブジェクトに焦点を合わせることのできる高解像度カメラ（≥8MP）を使用します。また、白色光に設定し、トランスイルミネーターといくつかのゲルイメージャは、高品質、再現性の高い画像を生成することができます。