이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 사람을 구별이 박테리아 종 대회 프로토콜의 중요한 단계는 억제제의 하룻밤 배양은 경쟁 분리를 첨가하기 전에 분리합니다. 억제제의 변형이 억제 화합물을 생산하는이 성장 기간을 필요로한다. 선수 변형이 동일한 매체 위에 중첩 된 바와 같이,이 방법은 모든 가능성을 관찰하는 연구를 할 수 있습니다 억제제 계통의 경쟁 균주의 성장을 방해합니다. 결과적으로, 이러한 분석은 자연 발생하는 반사; 하나의 분리가 완전히 틈새에 설정되고, 다른 성공적 틈새를 침투 할 수있는 억제 변수를 상쇄 할 수 있어야한다.
잘못 수행 한 경우 잘못된 결과가 발생할 가능성이 가장 높은이 프로토콜에 두 부분이 있습니다. 우선, 기화기 병 불완전 멸균 분석에 세균 오염을 도입 할 수있다. 인큐무균 용기의 단계 3.6에서 증발기 병 린스 사용 브로스 bation 완전히 살균 된 병을 확인하는데 사용될 수있다. 추가 살균이 필요한 경우 등 Virkon 같은 소독제 솔루션에 추가 세척은, 단계 3.2에 설명 된 표면 활성 세정제의 세척, 이전에 사용할 수 있습니다.
잘못된 결과가 발생할 수 있습니다 두 번째 단계는 경쟁 변형 (단계 6.1)의 희석이다. 희석이 최적이 아닌 경우, 억제의 명확한 측정은 쉽게 결정되지 않을 수 있습니다. 이 분석은 억제제 생산 S. 대 그람 – 양성 및 그람 – 음성 종의 넓은 범위에 걸쳐 균주 등의 다양한 코 균주를 사용하여 최적화되었다 선수 변형 7,8 등 구균 SH1000. 그것은 이후 경쟁 및 억제제 생산 균주 등 다양한-아굴라 부정적인와 아굴라 양성 포도상 구균을 사용하여 테스트되었습니다. 경쟁자로서 상기 이외의 속을 테스트 할 때변형, 접종에 대한 희석의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.
명확성 점수 반복 사이에서 크게 다를 경우, 특정 광학 밀도로 설정하여 경쟁 균주 접종을 표준화 할 필요가있을 수도있다. 그러나, 이것은 분석이 설정 취하고,이 실험에 따라 처리 할 수있다 변형의 수를 감소 할 가능성이있는 시간을 증가시킬 것이다. 시각적 신속한 대안을 제공 할 수있다 맥팔랜드 표준을 사용하여 적절한 OD로 배양을 조정.
이 기술의 한 가지 제한은 단지 박테리아 배양에 적용될 수 있다는 것이있다. 많은 연구 경쟁력 제외 상호 작용 3,4,13을 예측하기 16S rRNA의 염기 서열을 사용하는 이유입니다. 그러나, 유전 및 군 유전체학 기술은 종 수준으로 지역 사회 구성원을 구별 할 수 및 / 또는 특정 종자 간 특성의 변화를 설명하지 않습니다. particul의 연결을 선별 할 수있다박테리아 종 (5)의 유무와 특성을 인코딩 AR 유전자 그러나 이것은 종의 배제와 관련 될 가능성이 유전자의 사전 지식을 필요로한다.
이 기술의 안전 고려 사항은 박테리아의 에어로졸 생성으로 인해, 그것은 단지 레벨 2 안전 캐비닛과 함께 실험실에서 사용 또는 유사한 안전주의 사항과 함께 할 수 있다는 것입니다. 종자 간 특성의 변화를 설명하고 박테리아의 에어로졸을 생성하지 않는 균주 간의 경쟁을 테스트하는 다른 방법이 있습니다. 하나의 이러한 방법은 동시 길항 작용 분석법이있다. 이 방법에서는 하나의 분리의 접종은 한천 판에 확산되어, 제 1 건조되면 두 번째 분리 접종은 상단에 발견이나 칼에 찔린된다. 이 모두 억제 화합물을 생성 및 최초의 영양분을 소기하기 위해 경쟁 균주가 직접적인 경쟁 (동시 길항)에 환경을 생성합니다. advantag동시 길항 작용 분석을 통해 이연 성장 억제 분석의 전자는 억제제의 분리는 항상 완전 경쟁 분리의 침공하기 전에 설립되고의 경쟁 우위를 가지고 있어야한다는 것입니다. 또 다른 변형이 아니라 두 개의 분리가 동시에 8에 추가되지 않고, 추가되기 전에, 하나의 분리가 설립됩니다 대부분의 틈새에서와 같이이 환경에 무슨 일이 일어날 지 더 반사입니다.
또 다른 대안은 부어보다는 억제제의 분리에 분무 할 수있는 최고 한천에서 분리 선수를 추가하는 것입니다 박테리아의 에어로졸 발생을 방지 할 수 있습니다. 그러나, 톱 아가 추가의 체적은 플레이트에도 적용을 위해 약 3 ㎖가 될 필요가있다. 이 볼륨 내에서 경쟁의 분리는 억제제의 분리와 같은 미디어에 성장하지 않을 것이다, 그래서 감소 영양분으로 고생하지 않을 것입니다. 선수는 모든 UNT 억제 화합물과 직접 접촉하지 않을위원장은 상단 한천으로 확산. 이러한 분석은 연기 억제 또는 동시 길항 작용으로 설명 할 수 없습니다.
유사한 방법을 이전 임상 S. 사이 바시 트라 신 내성의 수준을 평가하기 위해 사용되어왔다 구균은 10를 분리합니다. (10)에 의해 기술 된 여기에 설명 된 프로토콜과 그 사이의 가장 큰 차이점은, 같은 민감한 (0 점수 inhibition- 선명도를 완료) 또는 저항 후자 만 분류 경쟁 균주이다 (더 inhibition- 선명도 부분 1-5 점수). 지연된 성장 억제 분석은 따라서 또한 다 약제 내성 병원균에 대해 활성 신규 항생제를 검색하더라도 특정 항균제 또는 생산자에 대한 내성 수준을 스크리닝하는데 사용될 수있다.
숙주 미생물이 세균 커뮤니티 (9)의 바람직하지 않은 멤버를 제거하기 위해 조작 될 수 있다고 제안되었다. 코리 네형 또는 포도상 구균의 응용 프로그램ylococcus 표피 이미 S.을 제거하는 것으로 나타났다 인구 11, 12의 상당한 부분에서 콧 구멍에 균 집락. 경쟁력있는 등 여기에 설명 된 것과 같은 기술을 통해 호스트 식물의 바람직하지 않은 회원을 제외 할 수 있습니다 특정 균주에 대한 연구는 따라서 미래의 치료제가 발생할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM은 유니레버 PLC를 (BB / L023040 / 1)와 함께 BBSRC-IPA 수상에 의해 투자된다. 현대차는 고등 교육 박사 과정 재학의 사우디 아라비아 정부에 의해 자금을 지원한다.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
References
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
