Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monositler, belirli kronik iltihaplı hastalıklar ile ilişkili hastalık ve iltihabı ile aktive edilebilir doğal immün hücrelerdir. monositlerin aktive efektör fonksiyonlarını ve artan glükoz taşıyıcı ekspresyonu eşlik glikolitik metabolizma oksidatif bir eşlik kaymasını teşvik eder. Bu artan glikolitik metabolizması da eğitim monositlerin bağışıklık, doğuştan gelen bağışıklık bellek form için gözlenmektedir. Monositler tarafından glükoz taşıyıcı ekspresyonu ve glukoz alımını incelemek in vitro protokol tarif edilmiş olmasına rağmen, hiçbiri tam kandaki sitometrisi çok parametre akışı ile incelenmiştir. (Ara-madde (CD14 ++ CD16 +) ve klasik olmayan – total monositler ve klasik (CD14 ++ CD16) tam kan floresan glikoz benzeri 2-NBDG alımının ölçümü için bir çok parametre akış sitometrik protokol açıklar CD14 + CD16 ++), monositsubpopülasyonunun. Bu yöntem, homeostaz ve enflamatuar hastalıkta toplam monositler ve monosit alt popülasyonlarının için glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını incelemek için kullanılabilir ve kolayca kan içindeki diğer lökositler ve lökosit alt popülasyonları için glükoz alımını incelemek için modifiye edilebilir.
Introduction
Monositler hızla enfeksiyon ve enflamasyonun 1 sitelere seferber insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. Monosit aktivasyonu patojenler ile akut zararın sınırlandırılması için çok önemlidir ve aynı zamanda ateroskleroz 2, kanser 3 ve HIV 4,5 dahil olmak üzere çeşitli kronik hastalıkların patojenezine merkezi.
Dinlenme ve aktive monosit metabolizması glikolitik metabolizmasını (yani glikoz fermantasyon laktat) kullanarak oksidatif metabolizmayı kullanan dinlenme monositler ve aktive edilmiş monositler ile, dramatik farklılık 6. Monosit aktivasyonu glikolitik metabolizması 7, artan glukoz alımına olanak glükoz taşıyıcıları ekspresyonunu indükler. Monosit glikoz taşıyıcısının 1 (GLUT1) aktivasyon sırasında yukarı düzenlenen böyle bir taşıyıcı ve sentezlenmesi v pro-enflamatuar sitokinlerin üretimine yol gösterilmiştiritro ve obez farelerin 8 adipoz dokusunda. Kaposi sarkomu ilişkili Herpes bir monositik hücre hattı enfeksiyonu GLUT1 9 hücresel upregülasyonu yol açar, ve en son, kronik HIV infeksiyonu sırasında GLUT1 eksprese eden monosit artan oranı, işlemden geçirilmemiş ve kombine antiretroviral tedavi ile tedavi edilen enfeksiyona 10 sırasında mevcut olduğunu göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar glukoz alımını ve monositler tarafından glikolitik metabolizması birçok enflamatuar hastalıkların önemli yönleri göstermektedir. Bu nedenle, basit bir yöntem homeostazı sırasında monosit GLUT1 ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçmek ve enflamatuar hastalık araştırmacılar geniş bir kullanım için olasıdır.
İnsan monositler hücre yüzey belirteçleri CD14 ve CD16 11,12 diferansiyel ifadesi ile muayene edilebilir üç ayrı alt oluşan varlık, heterojen. Klasik monositler CD14 yüksek düzeyde ifade ama CD'yi ifade etmezler16 (CD14 ++ CD16 -), orta monositler CD14 yüksek düzeyde ve CD16 (CD14 ++ CD16 +) orta düzeyde ve monositler CD14 düşük bir seviyede ve CD16 yüksek seviyede ifade eden klasik olmayan (CD14 ifade + CD16 ++). CD16 ifade monositler CD16 ile karşılaştırıldığında CD16 + monositler, denir – monositler yüksek inflamatuvar sitokinlerin ekspresyonunu ve yeteneğini daha etkin mevcut antijenlerin 13,14 gerekiyor. Monositler yaklaşık% 10'unda iltihap 15 gözlenen yüksek yüzdelerle homeostasis sırasında CD16 ifade eder. Monosit subpopülasyonunun Belirli hastalık durumları ile ilişkili hastalık ve hastalık ilerlemesinin 16 yararlı biyolojik göstergeler olabilir.
Amacımız PHY yakın koşullarda insan monositlerinde ve monosit alt populasyonları tarafından glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçebilen bir yöntem belirlemektirmümkün olduğu siological koşullar. Bu yöntemler fizyolojik koşullar 19 ile karşılaştırıldığında protein ekspresyonunu değişmiş olabilir izole monositler incelendiğinde olsa Önceki çalışmalar, monosit glukoz transporter ekspresyonunu ve glukoz alımını 17,18 ölçüldü ve hiçbir önceki çalışma insan monosit subpopülasyonunun incelemiştir. sitometri çok parametrik akışını kullanarak, toplam monositler ve monosit alt popülasyonlar tarafından floresan glikoz analog 2-NBDG glukoz transporter ekspresyonunu ve alımını incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır tam unmanipulated kan içinde (CD14 ve CD16 ifade dayanarak).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol tam kan monosit ve monosit alt popülasyonlar glukoz transporter ifade ve floresan glikoz analog alımını incelemek için basit bir yöntem ayrıntıları. Tam kan içinde bir 2-NBDG alımını değerlendirerek, bu teknik, in vivo benzer koşullar sağlar. Önceki bir çalışmada, yoğunluk santrifüj 17 kandan ayrılmış monositler 6-NBDG alımını incelenmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada potansiyel olarak belirli bir hücre yüzey molekülleri 19…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, HIV ve Hepatit Viroloji Araştırma AIDS Araştırma Washington Merkezi'nin Üniversitesi (SYAO), desteklenen ödül numarası AI027757 altında NIH tarafından finanse edilen programdan (ACH 2) ve 2010 gelişimsel hibe (CNIHR) Avustralya Merkezi tarafından finanse edildi aşağıdaki NIH Enstitüleri ve Merkezleri (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA) tarafından. CSP CNIHR ve ACH 2 hibe bir alıcı. SMC Avustralya (NHMRC) Anapara Araştırma Bursu bir Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi bir alıcı. Yazarlar minnetle Burnet Enstitüsü tarafından alınan Victoria Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı bu işe katkı kabul ediyorum. Biz eğitim ve teknik danışmanlık flow sitometri için AMREP Sitometrisi Core Tesisleri'nde gelen Geza Paukovic ve Eva Orlowski-Oliver yardım kabul. Biz medya koçluk ve video çekimi organizasyonu için Angus Morgan teşekkür ederiz. bizim şükranJesse Masson ve Jehad Abdülaziz K. alzahrani video çekimi sırasında laboratuvar yardım için. Biz kritik metodolojik öğütleri Tıp Bilimleri, UNSW, Avustralya Okulu'nda Dr. David Simar çabalarını teşekkür ederim. CSP teşekkür etmek istiyorum www.nice-consultants.com grafik istişareler için.
YAZARLARIN KATKISI:
CSP, projeyi gebe tasarlanmış ve deneyler yürüttüler, analiz ve veri yorumlanır ve el yazması yazdı. JJA verileri yorumlanır ve el yazması yazdı. TRB yazının yazdı. JMM, veri yorumlanır kritik entelektüel öneri yaptı ve el yazması gözden geçirilmiştir. SMC, veri yorumlanır kritik entelektüel öneriler yapılmış ve el yazması gözden geçirilmiştir.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
