Summary

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Published: August 12, 2016
doi:

Summary

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Abstract

Os monócitos são células imunitárias inatas que podem ser ativadas por patógenos e inflamação associados a certas doenças inflamatórias crónicas. A activação de monócitos induzem funções efectoras e um deslocamento concomitante da oxidativo ao metabolismo glicolítico que é acompanhada por um aumento da expressão do transportador de glucose. Este aumento do metabolismo glicolítico é também observada para a imunidade treinada de monócitos, uma forma de memória imunológica inata. Embora os protocolos in vitro que examinam a expressão do transportador de glucose e a captação de glicose pelos monócitos foram descritos, nenhum foi examinado por fluxo multi-paramétrico citometria em sangue total. Descreve-se um protocolo de citometria de fluxo multi-paramétrica para a medição da absorção de glucose análogo 2-NBDG fluorescente no sangue total pelo total de monócitos e a clássica (CD16 ++ CD14 -), intermediário (CD14 ++ CD16 +) e não clássico ( CD14 + CD16 ++) de monócitossubpopulações. Este método pode ser usado para examinar a expressão do transportador de glucose e a captação de glucose para o total de monócitos e subpopulações de monócitos durante a homeostase e doenças inflamatórias, e pode ser facilmente modificado para analisar a absorção de glucose por outros leucócitos e subpopulações de leucócitos de sangue dentro.

Introduction

Os monócitos são um dos principais componentes do sistema imune inato humano que são rapidamente mobilizados para os locais de infecção e inflamação 1. Activação dos monócitos é fundamental para limitar os danos aguda por patógenos e também é central para a patogênese de diversas doenças crônicas, incluindo a aterosclerose 2, do cancro de 3, e HIV 4,5.

O metabolismo de repouso e monócitos ativados difere radicalmente, com monócitos descansando utilizando metabolismo oxidativo e monócitos activados utilizando metabolismo glicolítico (ou seja, a fermentação da glicose em lactato) 6. A activação de monócitos induz a expressão dos transportadores de glicose que permite maior captação de glicose para o metabolismo glicolítico 7. transportador de glucose de monócitos 1 (GLUT1) é um tal transportador regulada positivamente durante a activação e a sua expressão tem sido mostrado para levar a produção de citocinas pro-inflamatórias em vITRO e no tecido adiposo de ratos obesos 8. A infecção de uma linha celular monocítica de sarcoma de Kaposi associada herpesvírus leva à sobre-regulação celular da Glut1 9, e, recentemente, mostraram que durante a infecção crónica pelo HIV um aumento da percentagem de monócitos que expressam GLUT1 estão presentes durante a infecção tratados com terapia anti-retroviral não tratada e 10 combinação. Tomados em conjunto, estes estudos mostram que a absorção de glicose e metabolismo glicolítico por monócitos são aspectos importantes de muitas doenças inflamatórias. Assim, um método simples para medir a expressão de monócitos GLUT1 e a absorção de glicose durante a homeostase e doença inflamatória é provável que seja de utilização de uma vasta gama de pesquisadores.

Os monócitos humanos são heterogéneo, sendo compreendido de três subconjuntos distintos que podem ser examinados por expressão diferencial de CD14 a marcadores da superfície celular CD16 e 11,12. Classical monócitos expressam um alto nível de expressão de CD14, mas não expressam CD16 (CD14 ++ CD16 -), monócitos intermediários expressam um alto nível de CD14 e um nível intermediário de CD16 (CD14 ++ CD16 +), e não-clássica monócitos expressam um baixo nível de CD14 e um alto nível de CD16 (CD14 + CD16 ++). Os monócitos que expressam CD16 são denominados CD16 + monócitos, que em comparação com CD16 monócitos têm alta expressão de citoquinas inflamatórias e a capacidade para mais efectivamente apresentar antigénios 13,14. Aproximadamente 10% dos monócitos expressam CD16 durante a homeostase com percentagens mais elevadas observadas durante a inflamação 15. Subpopulações de monócitos estão associados com certos estados de doença e podem ser marcadores biológicos úteis de doença e progressão da doença 16.

Nosso objetivo foi identificar um método que pode medir a expressão transportador de glicose e captação de glicose pelos monócitos humanos e subpopulações de monócitos em condições tão próximas phycondições fisiológi- possível. Estudos anteriores medido expressão do transportador de glucose de monócitos e a absorção de glicose 17,18, embora estes métodos examinados monócitos isolados que pode ter alterado a expressão da proteína em comparação com as condições fisiológicas 19, e nenhum estudo anterior examinou subpopulações de monócitos humanos. Usando fluxo multi-paramétrico citometria, nós descrevemos um método para examinar a expressão do transportador de glucose e a absorção do análogo de glucose fluorescente 2-NBDG pelo total de monócitos e subpopulações de monócitos (com base em CD14 e CD16 expressão) dentro de sangue inteiro não manipulada.

Protocol

NOTA: HIV-infectados e indivíduos não infectados pelo HIV foram recrutados a partir da Unidade de Doenças Infecciosas no Hospital Alfred de Melbourne, VIC, Austrália e da comunidade local, respectivamente. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa Alfred Hospital. Detecção de Superfície Celular 1. Glut1 em monócitos e de monócitos subpopulações Recolha de sangue em tubos anticoagulantes AC…

Representative Results

A compensação deve ser realizada para fluorocromos individuais para evitar transbordamento de fluorescência. Os monócitos são primeiramente enriquecido por gating com base na dispersão frontal e lateral. As parcelas apresentados são representantes de pelo menos seis experiências independentes realizadas em sangue total a partir de seis ou mais participantes, como previamente relatado 10 A Figura 1A mostra a propagação inicial de monócitos por disper…

Discussion

O protocolo descrito aqui detalha um método simples para examinar a expressão transportador de glicose e captação analógica glucose fluorescente por monócitos e monócitos subpopulações em sangue total. Ao avaliar a absorção de 2-NBDG em sangue total, esta técnica permite condições semelhantes aos in vivo. Um estudo anterior analisou-6 em monócitos NBDG absorção separadas do sangue total por centrifugação de densidade de 17. No entanto, este estudo não avaliou subpopulações de mo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelo Centro Australiano para HIV e Hepatite Virology Research (ACH 2) e uma subvenção de desenvolvimento de 2010 (CNIHR) da Universidade de Washington Center for AIDS Research (CFAR), um programa NIH financiados sob o número prêmio AI027757 que é apoiado pelo seguinte NIH institutos e centros (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP é um receptor da concessão 2 CNIHR e ACH. SMC é um destinatário de uma Health and Medical Conselho Nacional de Pesquisa da Austrália (NHMRC) principal Research Fellowship. Os autores agradecem a contribuição para este trabalho do Programa de Apoio Infra-estrutura Operacional Victorian recebido pelo Instituto Burnet. Nós reconhecemos a assistência de Geza Paukovic e Eva Orlowski-Oliver do Mecanismo AMREP Citometria de Fluxo Núcleo de citometria de fluxo formação e aconselhamento técnico. Agradecemos Angus Morgan para o treinamento de mídia e organização da gravação do vídeo. nossa gratidãopara Jesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani de assistência laboratório durante a gravação do vídeo. Agradecemos os esforços do Dr. David Simar da Faculdade de Ciências Médicas da UNSW, Austrália, que ofereceu aconselhamento metodológico crítico. CSP gostaria de agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:

CSP concebeu o projeto, concebido e realizado experimentos, analisados ​​e interpretados de dados, e escreveu o manuscrito. JJA interpretado de dados e escreveu o manuscrito. TRB escreveu o manuscrito. JMM interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito. SMC interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito.

Materials

VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10X) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C)

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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