Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monozyten sind angeborene Immunzellen, die mit bestimmten chronischen entzündlichen Erkrankungen durch Pathogene und Entzündung aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Monozyten induziert Effektorfunktionen und eine damit einhergehende Verlagerung von oxidativem zu glycolytic Stoffwechsel, die durch eine erhöhte Glukosetransporter-Expression begleitet wird. Diese erhöhte Glykolyse-Stoffwechsel ist auch für geübte Immunität von Monozyten, eine Form der angeborenen immunologischen Gedächtnisses beobachtet. Obwohl in vitro – Protokolle Glukosetransporters – Expression und die Glucoseaufnahme durch Monozyten untersucht wurden beschrieben, keines hat durch Mehr parametrischer Durchflusszytometrie in Vollblut untersucht. Wir beschreiben eine Multi-Parameter durchflusszytometrischen Protokoll für die Messung von fluoreszierender Glucoseanalog 2-NBDG Aufnahme in Vollblut durch Total Monozyten und der klassischen (CD14 ++ CD16 -), intermediäre (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen ( CD14 + CD16 ++) monocyteSubpopulationen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme für insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen während Homöostase und entzündliche Erkrankungen zu untersuchen, und kann leicht die Glukoseaufnahme modifiziert werden Subpopulationen für andere Leukozyten und Leukozyten im Blut zu untersuchen.
Introduction
Monozyten sind ein wichtiger Bestandteil der menschlichen angeborenen Immunsystems , die 1 bis Stellen der Infektion und Entzündung schnell mobilisiert werden. Aktivierung von Monozyten ist entscheidend für die Begrenzung akuten Schädigung durch Pathogene und auch von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von verschiedenen chronischen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 2, Krebs 3 und HIV 4,5.
Der Stoffwechsel von ruhenden und aktivierten Monozyten unterscheidet sich dramatisch, mit ruhenden Monozyten oxidativen Stoffwechsel zu nutzen und aktivierten Monozyten unter Verwendung von glykolytischen Metabolismus (dh Vergärung von Glukose zu Laktat) 6. Die Aktivierung von Monozyten induziert die Expression von Glucose – Transporter , die 7 für eine erhöhte Glukoseaufnahme für glykolytischen Stoffwechsel ermöglicht. Monozyt Glukosetransporter 1 (GLUT1) ist ein solcher Transporter nach oben reguliert während der Aktivierung und seine Expression wurde auf die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen in v zu führen gezeigtITRO und im Fettgewebe von fettleibigen Mäusen 8. Die Infektion einer monozytären Zelllinie durch das Kaposi – Sarkom assoziierten Herpes – Virus führt zu zellulären upregulation von GLUT1 9, und wir haben kürzlich gezeigt , dass während der chronischen HIV – Infektion eine erhöhte Anteil an GLUT1-exprimierenden Monozyten vorhanden sind , während der unbehandelten und Kombination antiretrovirale Therapie behandelten Infektion 10. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass die Glukoseaufnahme und glykolytischen Metabolismus durch Monozyten wichtige Aspekte der vielen Entzündungskrankheiten sind. Somit ist eine einfache Methode, Monozyten GLUT1-Expression und die Glukoseaufnahme während der Homöostase zu messen und entzündliche Erkrankungen ist wahrscheinlich auf ein breites Spektrum von Forschern von Nutzen zu sein.
Menschlichen Monozyten sind heterogene, aus drei verschiedenen Untermengen enthalten ist , die durch differentielle Expression der Zelloberflächenmarker CD14 und CD16 11,12 sucht werden können. Klassische Monozyten exprimieren ein hohes Maß an CD14, aber nicht ausdrücken CD16 (CD14 ++ CD16 -), Express- Zwischen Monozyten ein hohes Maß an CD14 und ein mittleres Niveau von CD16 (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen Monozyten ein niedriges Niveau von CD14 und ein hohes Maß an CD16 exprimieren (CD14 + CD16 ++). Monocyten , die CD16 exprimieren , werden CD16 + Monocyten bezeichnet, die CD16 im Vergleich – Monozyten haben eine hohe Expression von inflammatorischen Cytokinen und die Fähigkeit zu effektiver 13,14 Antigene. Etwa 10% der Monozyten exprimieren CD16 während der Homöostase mit höheren Anteilen während der Entzündung beobachtet 15. Monozytensubpopulationen sind mit bestimmten Krankheitszuständen verbunden sind und 16 nützliche biologische Marker der Krankheit und Krankheitsprogression sein könnte.
Unser Ziel war es, ein Verfahren zu identifizieren, die Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme durch menschliche Monozyten und Monozytensubpopulationen in Bedingungen so nahe PHY messen kannphysiologischen Bedingungen wie möglich. Frühere Studien Monozyten Glukosetransporter – Expression gemessen und die Glukoseaufnahme 17,18, obwohl diese Methoden isoliert Monozyten untersucht , die die Proteinexpression im Vergleich zu physiologischen Bedingungen geändert haben , können 19, und keine früheren Studie hat die menschliche Monozytensubpopulationen sucht. Mit Multi-parametrischer Durchflusszytometrie beschreiben wir eine Methode Glukosetransporter-Expression und die Aufnahme des fluoreszierenden Glucose analogen 2-NBDG von insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen zu untersuchen (basierend auf CD14 und CD16 Expression) innerhalb ganze unmanipulated Blut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll Details, ein einfaches Verfahren Glukosetransporter-Expression und fluoreszierende Glukose analoge Aufnahme durch Monozyten und Monozytensubpopulationen im Vollblut zu untersuchen. Durch die Bewertung 2-NBDG Aufnahme in Vollblut, erlaubt diese Technik für die Bedingungen ähnlich denen in vivo. In einer früheren Studie untersuchten 6-NBDG Aufnahme in Monozyten aus dem Vollblut durch Dichtezentrifugation 17 getrennt. Allerdings hat diese Studie nicht Monozytensubpopul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der australischen Zentrum für HIV und Hepatitis Virologie Forschung (ACH 2) und ein 2010 Entwicklungsbeihilfe (CNIHR) von der University of Washington Zentrum für AIDS – Forschung (CFAR), ein NIH finanzierte Programm unter Verleihungsnummer AI027757 finanziert , die unterstützt wird durch die folgende NIH Institute und Zentren (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP ist ein Empfänger der CNIHR und ACH 2 Zuschuss. SMC ist ein Empfänger einer National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Hauptforschungsstipendium. Die Autoren danken den Beitrag zu dieser Arbeit der viktorianischen operative Infrastruktur Support-Programm anerkennen vom Burnet Institute erhalten. Wir erkennen die Unterstützung von Geza Paukovic und Eva Orlowski-Oliver von der Amrep Flow Cytometry Core Facility für die Durchflusszytometrie Ausbildung und technische Beratung. Wir danken Angus Morgan für Medien-Coaching und Organisation der Videodreh. Unsere DankbarkeitJesse Masson und Jehad Abdulaziz K. Alzahrani für Labor Unterstützung während der Videoaufnahme. Wir danken den Bemühungen von Dr. David Simar an der School of Medical Sciences, UNSW, Australien, die kritische methodische Beratung angeboten. CSP dankt www.nice-consultants.com für Grafik Konsultationen.
AUTOREN BEITRAG:
CSP konzipierte das Projekt, entworfen und durchgeführten Experimenten, analysiert und interpretiert Daten und schrieb das Manuskript. JJA interpretierten Daten und schrieb das Manuskript. TRB schrieb das Manuskript. JMM interpretierten Daten, machte kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript. SMC interpretiert Daten, gemacht kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
