This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.
يفترض التصلب المتعدد ليكون أحد أمراض المناعة الذاتية التهابات، والتي تتميز تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مما أدى إلى ضعف الادراك والحركية. التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (بنت) هو نموذج حيواني مفيد لمرض التصلب العصبي المتعدد، لأنه يتميز أيضا تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي، إعاقة حركية ومدفوعة أيضا رد فعل المناعة الذاتية والالتهابات. هو فعل واحد من النماذج EAE مع الببتيد المستمدة من البروتين المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG) 35-55 في الفئران. الفئران EAE تطوير مسار المرض تدريجيا. وتنقسم هذه الدورة إلى ثلاث مراحل: المرحلة قبل السريرية (يوم 0-9)، وبداية ظهور أعراض المرض (يوم 10-11)، والمرحلة الحادة (يوم 12-14). وبفعل التصلب العصبي المتعدد وEAE من قبل خلايا T autoreactive أن اختراق الجهاز العصبي المركزي. هذه الخلايا T تفرز كيموكينات والسيتوكينات التي تقود إلى تجنيد مزيد من الخلايا المناعية. ولذلك، فإن توزيع الخلايا المناعية في الحبل الشوكي دأورينغ مراحل المرض الثلاثة تم التحقيق. لتسليط الضوء على نقطة زمنية من هذا المرض الذي تفعيل / انتشار / تراكم خلايا تي، الخلايا البائية وحيدات يبدأ، وجرى تقييم أيضا توزيع الخلايا المناعية في العقد اللمفاوية والطحال والدم. وعلاوة على ذلك، تم تحديد مستويات عدة السيتوكينات (IL-1β، IL-6، IL-23، TNFα، IFNγ) في مراحل المرض الثلاثة، إلى التبصر في العمليات الالتهابية للمرض. في الختام، تقدم البيانات لمحة عامة عن التعريف الوظيفي للخلايا المناعية خلال EAE علم الأمراض.
التصلب المتعدد (MS) ونموذج حيواني المقابلة لها، التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت)، تظهر التغييرات neuroinflammation المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). في وقت مبكر تتميز النشطة آفات التصلب العصبي المتعدد وEAE عن وجود خلايا مناعية تسلل. مسببات مرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف، ولكن يعتبر على نطاق واسع لإشراك تدمير المايلين بوساطة خلايا T autoreactive. هذه الخلايا T autoreactive تفرز السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات التي تجذب الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا البائية، وحيدات والعدلات من التداول. حيدات تفرق في الضامة. الانترفيرون غاما (IFNγ) التي يفرزها الخلايا التائية autoreactive يستقطب الضامة في الضامة الموالية للالتهابات. الموالية للالتهابات السيتوكينات الإفراج الضامة وأنواع الاكسجين التفاعلية التي تعزز موت الخلايا المبرمج في الخلايا قليلة التغصن. وفاة قليلة التغصن يؤدي إلى إزالة الميالين. وعلاوة على ذلك، وخلايا B تفرق في صخلايا lasma والأجسام المضادة الافراج ضد غمد المايلين، مما أدى في نهاية المطاف إلى تدهور المايلين. فقدان المايلين يؤدي إلى تدهور من المحاور والخلايا العصبية وبالتالي إلى تكوين مواقع الآفة في الجهاز العصبي المركزي والتي تمثل السمة الرئيسية لمرض التصلب العصبي المتعدد 1. في محيطها، يتم تنشيط خلايا T والخلايا B في الغدد الليمفاوية، فإنها تتكاثر في الطحال والهجرة من خلال تداول في النظام العصبي المركزي. وحيدات العدلات تتكاثر في نخاع العظام وأيضا تهاجر من خلال تداول في النظام العصبي المركزي.
الكريات البيض التسرب من نخاع العظم والطحال والغدد الليمفاوية في الدم أو من مجرى الدم إلى الجهاز العصبي المركزي هو عملية متعددة الخطوات التي تعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك التفاعلات الجزيئية بين الكريات البيض والبطانة بوساطة كيموكينات ومستقبلات chemokine. إنتاج كيموكينات من مختلف أنواع الخلايا يمكن أن يتسبب خلال reactio المناعةن من السيتوكينات مثل عامل نخر الورم α (TNFα)، IFNγ وانترلوكين 6 (IL-6)، التي تجند في وقت لاحق الخلايا المناعية لموقع التهاب 2،3. الخلايا المناعية تمثل مجموعة فرعية من المستقبلات chemokine على سطحها، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا ومسار الهجرة إلى الموقع التهابات. وبالتالي، يتم التعبير عن CXCR2، CCR1 وCXCR1 على العدلات الناضجة في نخاع العظام والدم 4، وربط بروابط لها، CXCL2، CCL5 أو CXCL6، على التوالي، وينشط العدلات وتعزز التصاق على البطانة وفي وقت لاحق، وهجرة الخلايا إلى أنسجة 5-9. CCL2 وCCL20 جذب وحيدات الخلايا TH1 / Th17 10، التي تعبر عن CCR2 11 و CCR6 12، على التوالي. CCR1 وCCR5، التي عبر عنها أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك خلايا T، وحيدات الضامة 13، ربط CCL3، CCL5 وCCL7 وupregulated خلال MS 14. وأعرب عن CXCR3 على خلايا T ويربط CCL9، CCL10 وCCL11 15.
استراتيجية واحدة رئيسية في علاج مرض التصلب العصبي المتعدد هو استنزاف الخلايا المناعية أو منع تسلل الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فقد تم التحقيق في تثبيط مستقبلات chemokine محددة في EAE. العداء أو الحذف الوراثي للCCR1 16، CCR2 17، CCR7 18 أو CXCR2 19 يقلل EAE علم الأمراض، في حين أن العداء أو الحذف الوراثي للCCR1 20، لم CCR5 20 أو CXCR3 21 لا يقلل من الأمراض. وبالتالي، فإن التعبير عن مستقبلات chemokine محددة على الكريات البيض هو أمر حاسم لتسلل هذه الأخيرة في الجهاز العصبي المركزي ويملي مسار EAE.
استنزاف الخلايا المناعية هو استراتيجية فعالة لعلاج مرضى التصلب المتعدد، وذلك لأن الخلايا المناعية تسلل تطلق السيتوكينات، مثل TNFα، IL-6 و IL-1β، التي، بدورها، وتعزيز عملية التهابية أو تدهور الخلايا العصبية 22. وعلاوة على ذلك، لصناعة السياراتخلايا TH1 رد الفعل تطلق IFNγ، والذي بدوره يحفز الضامة للافراج عن TNFα، IL-1β و IL-23.
توضح هذه المخطوطة تحريض EAE، وتحديد توزيع الخلايا المناعية ومستويات خلوى (مرنا) في الأنسجة المختلفة في الفئران EAE. تم عزل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة أثناء المرض إلى تقديم لمحة عامة تعتمد على الوقت من العمليات الالتهابية التي تؤدي في النهاية إلى تشكيل الآفة في الجهاز العصبي المركزي.
تلقت نموذج EAE هو موضح هنا بأكبر قدر من الاهتمام كنموذج للمرض التصلب العصبي المتعدد، ويستخدم بشكل روتيني في اختبار الاستراتيجيات العلاجية لمرض التصلب العصبي المتعدد 32. المرض الماوس يسلك العديد من المظاهر السريرية والنسيجية مرض التصلب العصبي المتعدد وسببه تحري…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.
ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |