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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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免疫与感染

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l'évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

La sclérose en plaques est présumée être une maladie inflammatoire auto-immune qui se caractérise par la formation de lésions dans le système nerveux central (SNC), résultant en une déficience cognitive et motrice. encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal utile de la sclérose en plaques, car elle est aussi caractérisée par la formation de lésions dans le système nerveux central, un trouble moteur et est également entraîné par des réactions auto-immunes et inflammatoires. L' un des modèles EAE est induite par un peptide dérivé de la protéine de myéline oligodendrocyte (MOG) 35-55 chez la souris. Les souris EAE développent un cours de maladie progressive. Ce cours est divisé en trois phases: la phase préclinique (jour 0-9), l'apparition de la maladie (jour 10 – 11) et la phase aiguë (jour 12-14). Sclérose en plaques et l'EAE sont induites par les lymphocytes T autoréactifs qui infiltrent le système nerveux central. Ces cellules T sécrètent des chimiokines et des cytokines qui conduit au recrutement d'autres cellules immunitaires. Par conséquent, la distribution des cellules immunitaires dans la moelle épinière dendant les trois phases de la maladie a été étudiée. Pour mettre en évidence le point de la maladie à laquelle l'activation / prolifération / accumulation de cellules T, les cellules B et les monocytes commence le temps, la distribution des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques, la rate et le sang a également été évaluée. En outre, les niveaux de plusieurs cytokines (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) dans les trois phases de la maladie ont été déterminées, afin de mieux comprendre les processus inflammatoires de la maladie. En conclusion, les données fournissent un aperçu du profil fonctionnel des cellules immunitaires au cours EAE pathologie.

Introduction

la sclérose en plaques (MS) et son modèle d'animal correspondant, encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), présentent des changements de la neuroinflammation auto-immunes du système nerveux central (SNC). Les lésions précoces de sclérose en plaques et EAE actives sont caractérisées par la présence de cellules immunitaires infiltrés. L'étiologie de la SEP demeure inconnue, mais est largement considérée comme impliquant la destruction de la myéline médiée par les cellules T autoréactives. Ces cellules T autoréactives sécrètent des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines qui attirent d'autres cellules immunitaires telles que les cellules B, les monocytes et les neutrophiles de la circulation. Les monocytes se différencient en macrophages. Interferon gamma (IFNy) sécrétée par la cellule T autoréactifs polarise les macrophages dans les macrophages pro-inflammatoires. Les cytokines pro-inflammatoires macrophages de libération et les espèces réactives de l'oxygène qui favorisent l'apoptose dans les oligodendrocytes. La mort des oligodendrocytes conduit à une démyélinisation. En outre, les cellules B se différencient en pcellules Lasma et autoanticorps de libération contre la gaine de myéline, en fin de compte résultant de la dégradation de la myéline. La perte de myéline entraîne une dégradation des axones et des neurones et ainsi à la formation de sites de lésion du SNC , qui représentent la principale caractéristique de la SP 1. Dans la périphérie, les cellules T et les cellules B sont activées dans les ganglions lymphatiques, ils prolifèrent dans la rate et migrent à travers la circulation dans le système nerveux central. Prolifèrent monocytes et neutrophiles dans la moelle osseuse et migrent également à travers la circulation dans le système nerveux central.

Extravasation des leucocytes de la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques dans le sang ou de la circulation sanguine dans le système nerveux central est un processus en plusieurs étapes qui dépend de plusieurs facteurs, y compris les interactions moléculaires entre les leucocytes et l'endothélium médiées par des chimiokines et des récepteurs de chimiokines. La production de chimiokines par divers types de cellules peut être induit pendant le reactio immunitairen par des cytokines telles que le facteur onconécrosant-α (TNF), IFN – y et d' interleukine-6 ​​(IL-6), qui recrute ensuite les cellules immunitaires vers le site de l' inflammation 2,3. les cellules immunitaires présentent un sous-ensemble de récepteurs de chimiokine sur leur surface, en fonction du type de cellule et la voie de migration vers le site inflammatoire. Ainsi, CXCR2, CCR1 et CXCR1 sont exprimés sur les neutrophiles matures dans la moelle osseuse et le sang 4 et la liaison de ses ligands, CXCL2, CCL5 ou CXCL6, respectivement, active les neutrophiles et favorise leur adhérence à l'endothélium et par la suite, la migration des cellules dans les tissus 5-9. CCL2 et CCL20 attirent les monocytes et les cellules Th1 / Th17 10, qui expriment CCR2 11 et CCR6 12, respectivement. CCR1 et CCR5 exprimés par différents types cellulaires, notamment les cellules T, les monocytes et les macrophages 13, se lient CCL3, CCL5 et CCL7 et qui sont régulés à la hausse au cours de MS 14. CXCR3 est exprimé sur les lymphocytes T et se lie CCL9, CCL10 etCCL11 15.

Une stratégie principale dans le traitement de la SEP est la diminution des cellules du système immunitaire ou à la prévention de l'infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central. Par conséquent, le blocage des récepteurs de chimiokines spécifiques a été étudiée dans l'EAE. Antagonisme ou délétion génétique de 16 CCR1, CCR2 , 17, 18 CCR7 ou CXCR2 19 réduit EAE pathologie, alors que l' antagonisme ou la deletion génétique de 20 CCR1, CXCR3 ou CCR5 20 21 ne réduisaient pas la pathologie. Par conséquent, l'expression des récepteurs de chimiokine sur les leucocytes spécifiques est essentielle pour l'infiltration de ce dernier dans le système nerveux central et dicte au cours de l'EAE.

L'appauvrissement des cellules immunitaires est une stratégie de traitement efficace pour les patients atteints de SEP, puisque les cellules immunitaires infiltrés libèrent des cytokines, telles que TNFa, IL-6 et IL-1β, qui, à leur tour, favorisent le processus inflammatoire ou la dégradation des neurones 22. En outre, auto-les cellules Th1 réactives libèrent IFNy, qui à son tour stimule les macrophages à libérer TNFa, IL-1β et de l'IL-23.

Ce manuscrit décrit l'induction de l'EAE, la détermination de la distribution des cellules immunitaires et les niveaux de cytokines (ARNm) dans divers tissus chez des souris atteintes d'EAE. Les cellules ont été isolés à différents moments au cours de la maladie afin de fournir une vue d'ensemble en fonction du temps des processus inflammatoires qui conduisent finalement à la formation de lésions dans le SNC.

Protocol

ÉTHIQUE DÉCLARATION: Nos procédures expérimentales sont approuvées par le Comité d'éthique du Regierungspräsidium Darmstadt (Allemagne) et confirment les réglementations nationales et européennes. Tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances des animaux et de réduire le nombre d'animaux utilisés. 1. EAE Modèle Induction du modèle EAE Utilisez 10 à 13 semaines d'âge 129S4 femme / SvJae × C57BL / 6 pour l'induction de l&#3…

Representative Results

La figure 1 donne un aperçu schématique des différentes méthodes décrites dans cet article. 1) Les souris reçoivent une injection de MOG antigène 35-55 et développent des symptômes cliniques initiales après 10,7 ± 0,3 jours 28. Une évolution de la maladie représentant des souris EAE est représenté sur la figure 1. 2) Divers tissus (rate, ganglions lymphatiques, de la moelle épinière…

Discussion

Le modèle EAE décrit ici a reçu le plus d' attention comme un modèle de sclérose en plaques et est couramment utilisé pour tester des stratégies thérapeutiques pour MS 32. La maladie de la souris présente de nombreuses caractéristiques cliniques et histologiques de la sclérose en plaques et est provoquée par l'induction d'une auto-immunité à des antigènes neuronaux. La sensibilisation aux antigènes de la myéline est associée à un dysfonctionnement du cerveau du sang barrière et…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
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References

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Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
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