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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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免疫与感染

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

다발성 경화증은인지 모터 손상에 기인하는 중추 신경계 (CNS)에서 병변 형성을 특징으로하는 염증성자가 면역 질환 인 것으로 추정된다. 이 또한 CNS 병변의 형성, 모터의 손상을 특징으로하며,자가 면역 및 염증 반응에 의해 구동되기 때문에 실험적자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 MS의 유용한 동물 모델이다. EAE 모델 중 하나는 미엘린 희소 돌기 아교 세포 단백질 생쥐 (MOG) 35-55 유래의 펩타이드로 유도된다. EAE 마우스는 진행성 질환 코스를 개발한다. 이 과정은 세 단계로 구분됩니다 전임상 단계 (하루 0-9), 질병 발병 (일 10-11) 및 급성기 (일 12-14). MS와 EAE는 CNS 침투 자기 반응성 T 세포에 의해 유발된다. 이러한 T 세포는 또한 면역 세포의 채용으로 이어질 케모카인 및 사이토 카인을 분비한다. 척수 (D)에 따라서, 면역 세포 분포세 가지 질병의 단계를 uring하는 조사 하였다. T 세포, B 세포 및 단핵 세포의 활성화 / 확산 / 축적이 시작되는 질병의 시점을 강조하기 위해, 림프절, 비장 및 혈액에서 면역 세포 분포는 또한 평가 하였다. 또한, 세 가지 질병 단계에서 여러 가지 사이토 카인 (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ)의 수준은 질환의 염증 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해, 측정 하였다. 결론적으로, 데이터는 EAE 병리 동안 면역 세포의 기능 프로파일의 개요를 제공한다.

Introduction

다발성 경화증 (MS)과 대응하는 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 중추 신경계 (CNS)에서,자가 면역 신경 염증 변화를 나타낸다. 초기 활성 및 MS EAE 병변 침투 면역 세포의 존재를 특징으로한다. MS의 병인은 알려져 있지 않다, 그러나 널리 자기 반응성 T 세포에 의해 매개되는 수초의 파괴를 포함하는 것으로 간주된다. 이 자기 ​​반응성 T 세포는 순환에서 B 세포, 단핵구 및 호중구와 같은 다른 면역 세포를 끌어 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비한다. 단핵 세포는 대 식세포로 분화. 자기 반응성 T 세포에 의해 분비 된 인터페론 감마 (IFNγ)는 염증성 식세포에 식세포 편광. 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸을 촉진 식세포 염증성 사이토 카인 방출 및 반응성 산소 종. 희소 돌기 아교 세포의 죽음은 탈수 초화로 연결됩니다. 또, B 세포는 P로 분화궁극적 미엘린의 열화 발생 lasma 세포 및 수초 대해 분리자가 항체. 수초의 손실은 신경 축삭 저하하여 MS (1)의 주요 특징을 나타내는 CNS의 병변 부위의 형성을 이끈다. 외주에서, T 세포와 B 세포는 림프절에서 활성화되고, 이들은 비장에서 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 이동한다. 단핵구 및 호중구가 골수 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 마이그레이션도.

혈액으로 또는 CNS에 혈액에서 골수, 비장과 림프절에서 백혈구의 혈관 외 유출은 케모카인과 케모카인 수용체에 의해 매개 백혈구와 내피 세포 사이의 분자 상호 작용 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다 다단계 과정이다. 다양한 유형의 세포에 의한 케모카인 생산은 면역 reactio 동안 유도 될 수있다이어서 2,3- 염증 부위로 면역 세포를 모집 종양 괴사 인자 α (TNFα), IFNγ 및 인터루킨 -6 (IL-6)와 같은 사이토 카인에 의해 N. 면역 세포는 염증성 사이트 세포 유형 및 이동 경로에 따라 그 표면에 케모카인 수용체의 서브 세트를 제시한다. 따라서, CXCR2, CCR1 및 CXCR1는 골수와 혈액 4 성숙 호중구에 표현, 그 리간드, CXCL2, CCL5 또는 CXCL6 결합되어, 각각 호중구를 활성화하고, 이후 세포의 이동을 내피에 자신의 접착을 촉진하고 조직 5-9로. CCL2 및 CCL20은 각각 CCR2 11 CCR6 (12)을 표현하는 단핵 세포와받은 Th1 / Th17 세포 (10)을 유치 할 수 있습니다. T 세포, 단핵구와 대 식세포 (13)를 포함하여 다른 세포 유형으로 표현 CCR1 및 CCR5, CCL3, CCL5 및 CCL7을 결합하여 MS (14) 중 상향 조절된다. CXCR3가 T 세포에 발현 및 CCL9, CCL10에 결합되고,CCL11 15.

MS 처리 한 주요 전략은 면역 세포의 고갈 또는 CNS로 면역 세포 침윤을 방지한다. 따라서, 특정 케모카인 수용체의 봉쇄 EAE에서 조사되었다. 길항 또는 CCR1 16, CCR2 (17)의 유전 삭제, CCR7 18 CXCR2 19 길항 또는 CCR1 (20)의 유전 삭제 반면, CCR5 20 CXCR3 (21)가 병리학을 감소하지 않았다 EAE 병리을 줄일 수 있습니다. 따라서, 특정 백혈구 케모카인 수용체의 발현은 CNS에 후자의 침투를위한 중요하고 EAE 과정을 지시한다.

침투 면역 세포는 차례로, 염증 또는 신경 (22)의 분해를 촉진, TNFα, IL-6 및 IL-1β와 같은 사이토 카인을 방출하기 때문에 면역 세포의 고갈은 MS 환자의 효과적인 치료 전략이다. 또한, 자동반응 Th1 세포는 다시 TNFα, IL-1β 및 IL-23을 출시 할 대 식세포를 자극 IFNγ을 놓습니다.

이 원고 EAE 면역 세포 분포 EAE 마우스의 다양한 조직에서 사이토킨 수준 (mRNA의) 결정의 유도를 설명한다. 세포를 마지막 CNS 병변의 형성으로 이어질 염증 과정의 시간 의존성에 대한 개요를 제공하는 질환 과정에서 다른 시점에서 분리 하였다.

Protocol

윤리 선언문 : 우리의 실험 절차는 Regierungspräsidium 다름슈타트 (독일)의 윤리위원회의 승인을 국내 및 유럽 규정을 확인하고 있습니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용하는 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다. 1. EAE 모델 EAE 모델의 유도 EAE의 유도를 위해 10 13 주령 여성 129S4 / SvJae × C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 상단에, 쥐에게 피하 …

Representative Results

그림 1은이 문서에서 설명하는 다른 방법의 개략적 인 개요를 제공합니다. 1) 마우스는 MOG 35-55 항원의 주사를 수신 및 10.7 ± 0.3 일 (28) 후 초기 임상 증상을 개발한다. EAE 마우스의 대표적인 질병 코스. 그림 1과 2) 다양한 조직 (비장, 림프절, 요추 척수)에 표시되고 혈액은 전임상 단계 (2 일, 4 일 동안 서로 …

Discussion

여기에 설명 된 EAE 모델은 MS의 모델로 가장 주목을 받고 있으며, 통상적으로 MS (32)에 대한 치료 적 전략을 시험에 사용된다. 마우스 질병은 MS의 많은 임상 및 조직 학적 특징을 나타내고 신경 세포의 항원에 대한자가 면역의 유도에 의해 발생합니다. 미엘린 항원에 감작은 CNS 내로 혈액 뇌 장벽 부전함으로써 면역 세포의 침윤과 관련된다. 우리의 연구 결과는 면역 세포가 급성 단계에서 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
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Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
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