Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.
Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.
Medfödda immunceller utgör en väsentlig andel av cellerna inuti tumörmikroomgivningen och har associerats med tumör malignitet hos patienter och djurmodeller av cancer 1. På senare tid har det blivit mer allmänt uppskattat att kroniska immunsvar spelar avgörande roller för att främja tumörprogression, metastas och motståndskraft mot kemoterapier 2. Makrofager är viktiga medfödda immunceller som har visat att direkt reglera tumörcellsvar på kemoterapi 3,4. Dock är betydelsen av neutrofiler, viktiga aktörer i det medfödda immunförsvaret, i reglering av tumörrespons till anticancerbehandling inte känd. Syftet med dessa protokoll är att använda en snabb och trovärdig metod för att separera neutrofiler från CLL patients blodprov och differentiera HL60 celler längs granulocytiska vägen för att studera deras roll vid reglering av känsligheten hos lymfomceller till anti-lymfommedel.
<p class= "jove_content"> Neutrofiler är den vanligast förekommande cellulära komponenten av det medfödda immunförsvaret i blod 5 och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer 6. Neutrofiler har en viktig roll i stigande effektiva medfödda immunsvar utöver variabla effektorfunktioner i flera patologiska tillstånd 7. Därför är en snabb och trovärdig metod för att isolera neutrofiler från andra blodceller, såsom densitetsgradient separationsmetod, krävs för in vitro-studier. Med den här metoden för neutrofil isolering kommer att underlätta ytterligare forskning på neutrofila-medierad immunologiska funktioner in vivo och ex vivo.Förmågan att erhålla rena populationer av neutrofiler är ett viktigt första steg för att undersöka patienter med immunologiska sjukdomar 8. Densitetsgradient separationsmetod är en idealisk teknik i vilken ett högt utbyte av celler erhålles. den metod innebär tillsättning av densitetsgradientlösningen i botten av ett rör innehållande utspädd humant blod följt av centrifugering vid 300 g under 35 min utan avbrott. Ringen av de mononukleära cellerna visas vid gränsytan och neutrofilerna uppe under det första. Denna metod har betydande fördelar i förhållande till andra tillgängliga metoder såsom neutrofila isoleringssatser, vilka är mycket dyrare 9. Dessutom isolera neutrofiler från humant blod genom kommersiella kit med användning av antikroppar riktade mot en ytmarkör specifik för humana neutrofiler, öka risken för cellaktivering eller differentiering. Densitetsgradient separation metod tillåter isolering av neutrofiler inom en kort tidsperiod. Inom samma steg, är mononukleära celler också separeras och utvinnas. Det är en grundläggande teknik i vilken ett högt utbyte av rena celler erhålls för att uppnå funktionella integritet.
För att efterlikna tumör microenvironment, 3D-experiment utfördes. Med tanke på den korta halveringstiden av neutrofiler in vitro, 3D experiment med färska humana neutrofiler är inte avgörande. Av denna anledning är promyelocytiska (HL60) celler induceras att differentiera till neutrofil-liknande celler med användning av de differentierings inducerare dimetylsulfoxid (DMSO) och retinsyra (RA). Använda differentierade HL60-celler (HL60 diff) kommer att förhindra att ha olika svar av neutrofiler på grund av isolering från olika givare.
In vitro 3D kulturmodeller utgör ett mellansteg mellan 2D in vitro-modeller och in vivo-modeller. I 2D-kultur, cellerna spreds på plastytan bildar onaturliga cell bilagor till deponerade proteiner som denaturerade på denna syntetiska yta. Omvänt cellerna i 3D kultur bildar naturlig cell-cell bilagor eftersom cellerna och den extracellulära matrisen de syntetisera är naturmaterial till vilka de är bundna.Av denna anledning, 3D co-kulturmodeller, särskilt mellan cancerceller och andra celltyper, har varit mycket användbara för att indikera deras bidrag till tumörtillväxt, angiogenes och metastas. Som ett resultat, 3D-kulturer göra cellkulturen härma de fysiologiska förhållanden som råder in vivo 10.
Beskrivs här, en effektiv, enkel, snabb och billig protokoll för isolering av neutrofiler från humant blod med hög renhet med användning av densitetsgradientcentrifugering tillvägagångssätt och inom samma steg mononukleära celler är också separeras och utvinnas. De isolerade cellpopulationer är ≥90% ren.
Flera metoder finns tillgängliga för neutrofila isolering från humant blod. Dessa innefattar liknande metoder med användning av diskontinuerliga gradienter 11,12,</sup…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).
RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
Vincristine | EG labo | ||
BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight before the day of the experiment |
Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |