Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Células inmunes innatas constituyen una proporción esencial de las células dentro del microambiente del tumor y se han asociado con la malignidad del tumor en pacientes y modelos animales de cáncer ^1. Recientemente, se ha vuelto más ampliamente apreciado que las respuestas inmunes crónicas desempeñan papeles críticos en la promoción de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a quimioterapias ^2. Los macrófagos son importantes células inmunitarias innatas que se han demostrado para regular directamente la respuesta de las células tumorales a la quimioterapia ^3,4. Sin embargo, el papel de los neutrófilos, los actores clave en el sistema inmunitario innato, en la regulación de la respuesta del tumor al tratamiento contra el cáncer no se conoce. Los objetivos de estos protocolos son el uso de un método rápido y fiable para separar los neutrófilos de muestras de sangre CLL del paciente y para diferenciar las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica con el fin de estudiar su papel en la regulación de la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes anti-linfoma.

<p class= "jove_content"> Los neutrófilos son el componente celular más abundante del sistema inmune innato en la sangre ⁵ y actuar como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores ^6. Los neutrófilos tienen un papel esencial en el aumento de la respuesta inmune innata eficaces, además de las funciones efectoras variables en varias condiciones patológicas ^7. Por lo tanto, un método rápido y fiable para aislar los neutrófilos de otras células sanguíneas, tales como método de separación en gradiente de densidad, se requiere para los estudios in vitro. El uso de este método para el aislamiento de neutrófilos facilitará aún más la investigación sobre las funciones inmunológicas mediada por neutrófilos in vivo y ex vivo.

La capacidad de obtener poblaciones puras de los neutrófilos es un primer paso importante para la investigación de los pacientes con enfermedades inmunológicas ^8. método de separación en gradiente de densidad es una técnica ideal en el que se obtiene un alto rendimiento de las células. el method implica la adición de la solución de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo que contiene la sangre humana diluido seguido de centrifugación a 300 g durante 35 min sin descanso. El anillo de las células mononucleares aparece en la interfase y los neutrófilos residen por debajo de la primera. Este método tiene ventajas significativas con respecto a otros métodos disponibles, tales como kits de aislamiento de neutrófilos, que son mucho más caros ^9. Además, el aislamiento de los neutrófilos de sangre humana por kits comerciales que utilizan anticuerpos dirigidos a un marcador de superficie específico para los neutrófilos humanos, aumentar el riesgo de activación o diferenciación celular. método de separación en gradiente de densidad permite el aislamiento de neutrófilos dentro de un corto período de tiempo. Dentro del mismo paso, también se separan y se recuperan las células mononucleares. Es una técnica fundamental en la que se obtiene un alto rendimiento de células puras a fin de lograr la integridad funcional.

Con el fin de imitar la microenv tumorironment, se realizaron experimentos en 3D. Dada la corta vida media de los neutrófilos in vitro, los experimentos en 3D con los neutrófilos humanos frescos no son concluyentes. Por esta razón, se inducen las células HL60 promielocítica () para diferenciarse en células de neutrófilos como el uso de los inductores de la diferenciación dimetilsulfóxido (DMSO) y el ácido retinoico (RA). El uso de células HL60 diferenciadas (HL60) diff evitará tener diferentes respuestas de los neutrófilos debido al aislamiento de diferentes donantes.

En 3D vitro modelos de cultivo representan una etapa intermedia entre modelos 2D in vitro y en modelos in vivo. En la cultura 2D, las células se extienden sobre una superficie de plástico que forma los archivos adjuntos de células no naturales a las proteínas depositadas que se desnaturalizan en esta superficie sintética. Por el contrario, las células en forma de cultivo 3D adjuntos célula-célula natural, ya que las células y la matriz extracelular que sintetizan son el material natural a los que están unidos.Por esta razón, los modelos 3D de co-cultivo, especialmente entre las células cancerosas y otros tipos de células, han sido muy útiles para indicar su contribución al crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis. Como resultado, los cultivos 3D hacen que el cultivo de células de imitar las condiciones fisiológicas que existen in vivo ^10.