Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme
Summary
Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.
Abstract
Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır.
<p class= "jove_content"> Nötrofiller mikroorganizmaları 6 işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan 5 ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda 7 değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır.Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların 8 hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g'de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha 9 pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik.
Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir.
In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo 10 mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır.
Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).
Materials
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
