Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Medfödda immunceller utgör en väsentlig andel av cellerna inuti tumörmikroomgivningen och har associerats med tumör malignitet hos patienter och djurmodeller av cancer ^1. På senare tid har det blivit mer allmänt uppskattat att kroniska immunsvar spelar avgörande roller för att främja tumörprogression, metastas och motståndskraft mot kemoterapier ^2. Makrofager är viktiga medfödda immunceller som har visat att direkt reglera tumörcellsvar på kemoterapi ^3,4. Dock är betydelsen av neutrofiler, viktiga aktörer i det medfödda immunförsvaret, i reglering av tumörrespons till anticancerbehandling inte känd. Syftet med dessa protokoll är att använda en snabb och trovärdig metod för att separera neutrofiler från CLL patients blodprov och differentiera HL60 celler längs granulocytiska vägen för att studera deras roll vid reglering av känsligheten hos lymfomceller till anti-lymfommedel.

<p class= "jove_content"> Neutrofiler är den vanligast förekommande cellulära komponenten av det medfödda immunförsvaret i blod ⁵ och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer ^6. Neutrofiler har en viktig roll i stigande effektiva medfödda immunsvar utöver variabla effektorfunktioner i flera patologiska tillstånd ^7. Därför är en snabb och trovärdig metod för att isolera neutrofiler från andra blodceller, såsom densitetsgradient separationsmetod, krävs för in vitro-studier. Med den här metoden för neutrofil isolering kommer att underlätta ytterligare forskning på neutrofila-medierad immunologiska funktioner in vivo och ex vivo.

Förmågan att erhålla rena populationer av neutrofiler är ett viktigt första steg för att undersöka patienter med immunologiska sjukdomar ^8. Densitetsgradient separationsmetod är en idealisk teknik i vilken ett högt utbyte av celler erhålles. den metod innebär tillsättning av densitetsgradientlösningen i botten av ett rör innehållande utspädd humant blod följt av centrifugering vid 300 g under 35 min utan avbrott. Ringen av de mononukleära cellerna visas vid gränsytan och neutrofilerna uppe under det första. Denna metod har betydande fördelar i förhållande till andra tillgängliga metoder såsom neutrofila isoleringssatser, vilka är mycket dyrare ^9. Dessutom isolera neutrofiler från humant blod genom kommersiella kit med användning av antikroppar riktade mot en ytmarkör specifik för humana neutrofiler, öka risken för cellaktivering eller differentiering. Densitetsgradient separation metod tillåter isolering av neutrofiler inom en kort tidsperiod. Inom samma steg, är mononukleära celler också separeras och utvinnas. Det är en grundläggande teknik i vilken ett högt utbyte av rena celler erhålls för att uppnå funktionella integritet.

För att efterlikna tumör microenvironment, 3D-experiment utfördes. Med tanke på den korta halveringstiden av neutrofiler in vitro, 3D experiment med färska humana neutrofiler är inte avgörande. Av denna anledning är promyelocytiska (HL60) celler induceras att differentiera till neutrofil-liknande celler med användning av de differentierings inducerare dimetylsulfoxid (DMSO) och retinsyra (RA). Använda differentierade HL60-celler (HL60 diff) kommer att förhindra att ha olika svar av neutrofiler på grund av isolering från olika givare.

In vitro 3D kulturmodeller utgör ett mellansteg mellan 2D in vitro-modeller och in vivo-modeller. I 2D-kultur, cellerna spreds på plastytan bildar onaturliga cell bilagor till deponerade proteiner som denaturerade på denna syntetiska yta. Omvänt cellerna i 3D kultur bildar naturlig cell-cell bilagor eftersom cellerna och den extracellulära matrisen de syntetisera är naturmaterial till vilka de är bundna.Av denna anledning, 3D co-kulturmodeller, särskilt mellan cancerceller och andra celltyper, har varit mycket användbara för att indikera deras bidrag till tumörtillväxt, angiogenes och metastas. Som ett resultat, 3D-kulturer göra cellkulturen härma de fysiologiska förhållanden som råder in vivo ^10.