神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
比較的静止体性幹細胞は、大部分の成体組織における生涯細胞の再生をサポートしています。成人の哺乳類の脳内の神経幹細胞は、2つの特定の神経因性ニッチに制限されている：海馬における歯状回および心室-脳室下帯の顆粒下ゾーン（V-SVZを、また、上衣ゾーンまたはSEZと呼ばれる）の横の壁に心室。長期幹細胞における所望の導入遺伝子の発現およびそれらの派生子孫を生じる（ すなわち、哺乳動物の脳のもの）成体幹細胞集団のためのin vivo遺伝子導入戦略の開発は、現在、生物医学及びバイオテクノロジー研究において重要なツールです。ここでは、直接in vivo法は、LVのによる細胞周期に依存しない感染症およびV-SVZニッチの専門性の高い細胞構築を活用して成体マウスV-SVZ細胞の安定な遺伝的改変のために提示されています。具体的には、現在のプロトコルが関与しますV-SVZ自体のいずれかに特異的な導入遺伝子発現カセットをコードする空のLV（対照）またはのLVの注入は、上衣のターゲティングのために、in vivoでのニッチ内の細胞のすべてのタイプのターゲティングのために、または側脳室の内腔に、よ細胞のみ。発現カセットは、次にできるよう、またのLVによってコード導入された細胞と蛍光タンパク質のゲノムに組み込まれている標識された細胞とにおける細胞自律非自律、ニッチ依存効果の分析のための形質導入された細胞の検出、それら子孫。
Introduction
マウス心室脳室下帯（V-SVZ）、線条体に面した側脳室の壁には、嗅球の持続的な生産における前駆細胞の複製と分化の結果の中で継続的なプロセス（OB非常にアクティブな胚領域であり、 ）介在ニューロンと脳梁オリゴデンドロサイト1。 、星状細胞抗原グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現し、このようなネスチン、Id1のような細胞マーカー幹;これらの細胞の生涯の生成は、神経幹細胞（別名B1細胞のNSC）のこの領域に存在することによってサポートされているように見えます及びSox2の2。 GFAP発現B1細胞は、トランジット増幅前駆細胞転写がDLX2（遠位レスホメオボックス2）及びASCL1（哺乳類achaete-schuteホモログ1）を係数表現（TAP）細胞（C細胞）を、生成し、それらが生じる前に、急速に数回を分割神経芽細胞（A細胞）またはoligodendroblasts 3を移行します。新たに生成されたproliferative神経芽細胞は、彼らが粒状と差別化抑制性などの糸球体層に統合OBへの吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を形成し、前方に移行します。移行若いoligodendroblastsは、彼らが局所的に分割または成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト1,4に分化していき未熟NG2陽性細胞となるCC、に移動。
胎児の放射状グリア細胞に由来B1細胞は、前任者の細長い偏光形態を保持し、それらのニッチで専門性の高い関係を示します。彼らはどのラインアップ心室とV-SVZニッチを灌漑血管のネットワークを上衣の間にまたがります。 multiciliated ependymocytes間のB1細胞のインターカレーションの小さな頂端プロセスおよび単一の非運動性の一次繊毛で終了し、その基礎プロセスはb。で、このニッチな結末を灌漑平面血管叢に近づくために長い距離を拡張し、一方、叢毛細血管2,5-8のASALラミナ。
無傷のV-SVZニッチでも、GFAP +である非神経性アストロサイトからB1-のNSCを区別するための最も確実な方法は、全マウント心室側壁の準備と3次元共焦点顕微鏡によるそれらの分析の後に基づいています各繊毛5,8の程度を標識するcilial基礎体またはアセチル化αチューブリンのマーカーとして細胞膜を描写するために、βカテニンを薄B1-NSC頂端プロセスにラベルを付け、およびγチューブリンのいずれかのためにGFAPの免疫染色。心室の表面からこれらの全マウントの観察は、B1及び上衣細胞は、1つまたは複数のGFAP + B1細胞の頂端uniciliatedプロセスはmulticiliated上衣細胞のロゼットで囲まれている中で「風車」5に配置されていることが示されています。
B1細胞の特徴的な形態は、実験的証拠と相関する私NSCを2,6,9-11に作用する可溶性シグナルの調節源を構成している血管/内皮細胞ndicatingおよび脳脊髄液（CSF）を心室。心室表面では、上衣とB1細胞が関与する同型と異apico-横相互作用がタイトジャンクションが含まれており、接合部5,12をアドヘレン。また、例えば、N-カドヘリン及びV-CAMとしてB1と上衣細胞との間の接合部複合体に関与する接着分子は、高度に組織化されたV-SVZニッチにおけるB1の位置決めだけでなく、それらの静止12だけでなく、調節することが示されています、13。上衣-B1細胞単層は、CSFから水および小分子の調節されたフラックスを可能にする拡散バリアとして機能するように見えますが、大きなタンパク質10,11の間の通路を制限します。実験的証拠は、一意に位置付けB1細胞頂端繊毛は、CSF 2に存在するポリペプチドシグナリングのセンサーとしての役割を果たし得ることを示しています5-7。上衣細胞はまた、それ自体が、NSCの挙動14,15の調節における役割と可溶性および膜結合信号の源です。
例えばブロモデオキシウリジン（BrdUの）、またはレトロウイルスなどの追跡可能なヌクレオシドは、広くインビボでのNSCを含む前駆細胞を標識するために使用されてきました。 BrdUの信号が繰り返される細胞分裂およびレトロウイルスを介して希薄しかし、これらの方法は、長期的な運命のトレースには最適ではない優先的に一過性に形質導入16,17のための細胞増殖のそれらの要件のために増幅する細胞を標的とするように見えます。 B1-NSCのは、主に静止状態であり、その近隣の上衣細胞は、生理的条件3の下で分裂したことがないようにニッチなコンポーネントとの相互作用を含む、in vivoで NSCの生理機能を調べるために、稀に分割していない細胞を標識し、追跡する方法を確立することが重要です。ここでは、レンチウイルスベクター（LVの）は、高効率遺伝子マークを可能にすることを示していまする最も合理形質導入すると、細胞周期に依存しない方法で標的細胞のゲノム中に統合するそれらの能力のために、成体のNSCおよび非分裂上衣細胞の長期的修飾、。さらに、私達は配達、特に上衣細胞を形質導入するウイルス力価のヘルプのルートが、B1ない細胞は、それによってのNSCにニッチに依存し、上衣効果の分析を可能にする方法を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
LVSは大人のNSC 16,18の遺伝的改変のための他のウイルスシステムに比べて重要な利点を提供します。 V-SVZニッチへのレンチウイルスの定位配信は、ラベルを付け、そのような複数の細胞分裂後に希釈されたBrdU、またはレトロウイルスなどの他の一般的に使用される方法の限界を克服B1-のNSCを分割まれにトレースし、細胞のみを標的とするための効率的な方法を表し、それは、アプリケ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、MJパロップと大学・デ・バレンシアのSCSIEの技術支援の助けを認めます。我々はまた、有用なコメントや原稿の議論のためアントニアFollenziに感謝します。フンダシオンBotinのによってサポートされている場合は、そのサンタンデール大学グローバル部門を通じてバンコ・サンタンデールによると、Generalitatのバレンシア（PROGRAMAプロメテオ、ACOMP、およびISIC）とMINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（：SAF2011-23331、CIBERNED及びRETICターセルMINECO）からの助成金によって、 。この作品は、また、（260511- MINECO と欧州研究評議会（ERC）2012-STGからBFU2010-21823とRETICターセル助成金によってサポートされていました AC BM-P へのPD-HUMMODEL）。 MINECOのスペインFPIの交わりの受信者です。
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
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