مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
نسبيا هادئة الخلايا الجذعية الجسدية تدعم تجديد الخلايا مدى الحياة في معظم أنسجة البالغين. وتقتصر الخلايا الجذعية العصبية في البالغين أدمغة الثدييات لاثنين من منافذ العصبية محددة: منطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن في قرن آمون ومنطقة البطين subventricular (V-SVZ، وتسمى أيضا منطقة تحت البطانة العصبية أو المناطق الاقتصادية الخاصة) في جدران الجانبية البطينين. تطوير في الجسم الحي استراتيجيات نقل الجينات للسكان الخلية الجذعية البالغة (أي تلك التي أدمغة الثدييات) مما أدى إلى التعبير على المدى الطويل من الجينات المحورة المطلوب في الخلايا الجذعية وذريتها المشتقة هي أداة حاسمة في مجال البحوث الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية الحالي. هنا، يتم تقديم الطريقة المباشرة في الجسم الحي للتعديل الجيني مستقر من خلايا-V SVZ الماوس الكبار أن يستفيد من العدوى دورة مستقلة الخلية لفس والتهندس الخلوي درجة عالية من التخصص من مكانة-V SVZ. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي ينطويق حقن لفس فارغة (السيطرة) أو لفس ترميز أشرطة التعبير التحوير معين إما إلى V-SVZ نفسها، لفي الجسم الحي استهداف جميع أنواع الخلايا في محراب، أو في تجويف البطين الجانبي، لاستهداف البطانة العصبية الخلايا فقط. ثم يتم دمج أشرطة التعبير في جينوم الخلايا transduced والبروتينات الفلورية، المشفرة أيضا لفس، والسماح للكشف عن الخلايا transduced لتحليل الخلية آثار المستقلة وغير المستقلة، التي تعتمد على مكانة في الخلايا المسمى والخاصة ذرية.
Introduction
والبطين subventricular منطقة الفئران (V-SVZ)، في جدران البطين الجانبي التي تواجه المخطط، هي منطقة جرثومي نشطة جدا فيه عملية مستمرة من تكرار خلية سلفية والتمايز النتائج في إنتاج مستمر من البصلة الشمية (OB ) interneurons و oligodendrocytes جسم الثفني 1. يظهر جيل مدى الحياة من هذه الخلايا لتكون معتمدة من قبل وجود في هذه المنطقة من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs، وتسمى أيضا الخلايا B1)، والتي تعبر عن مستضد نجمي الخلايا ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) ووقف علامات الخلية مثل nestin، ID1 وSox2 2. GFAP، معربا عن الخلايا B1 تولد عبور تضخيم السلف (وات) الخلايا (خلايا C)، التي تعبر عن النسخ عوامل Dlx2 (القاصي أقل علبة مثلية 2) وAscl1 (الثدييات-achaete شووت homolog 1) والانقسام بسرعة عدة مرات قبل أن تؤدي لالمهاجرة neuroblasts (خلايا) أو oligodendroblasts 3. حديثا ولدت-prolifneuroblasts erative تهاجر الأمامية، وتشكيل تيار الهجرة منقاري (RMS) إلى OB، حيث الاندماج في منطقة الحبيبية وطبقات الكبيبي كما interneurons المثبطة متباينة. المهاجرة oligodendroblasts الشباب الانتقال إلى CC، حيث تصبح غير ناضجة الخلايا NG2 الإيجابي الذي يستمر لتقسيم محليا أو تفرق في الخلايا قليلة التغصن myelinating ناضجة 1،4.
خلايا B1، التي تستمد من الخلايا الدبقية شعاعي الجنين، في الحفاظ على التشكل ممدود والاستقطاب أسلافهم وتظهر علاقة متخصصة للغاية مع مكانها المناسب. انها تمتد بين بطانة عصبية الذي يصطف البطين وشبكة من الأوعية الدموية التي تروي المتخصصة-V SVZ. عملية قمي صغيرة من الخلايا intercalates B1 بين ependymocytes multiciliated وتنتهي في هدب أساسي واحد غير متحرك، في حين أن عملية القاعدية التي تمتد لمسافات طويلة للاقتراب من الضفيرة الوعائية مستو الذي يروي هذا المتخصصة تنتهي في بالصفيحة العسل من الشعيرات الدموية الضفيرة 2،5-8.
الطريقة الأكثر موثوقية للتمييز B1-NSCs من الخلايا النجمية غير العصبية، والتي هي أيضا GFAP +، في محراب-V SVZ سليمة تقوم على كامل جبل الاستعدادات من البطين الجدار الجانبي وتحليل من قبل 3-D متحد البؤر المجهري بعد المناعية لGFAP لتسمية رقيقة B1-NSC عملية قمي، β-كاتينين لتحديد أغشية الخلايا، وإما γ تويولين كعلامة الهيئات القاعدية الهدبية أو الأسيتيل α تويولين لتسمية مدى كل هدب 5،8. وأشارت ملاحظات هذه يتصاعد كلها من سطح البطين أن الخلايا B1 و البطانة العصبية مرتبة في "دواليب الهواء" 5، والتي هي مطوقة العمليات قمي uniciliated من واحد أو عدة GFAP + B1 الخلايا وردة من خلايا البطانة العصبية multiciliated.
مورفولوجيا مميزة من الخلايا B1 يرتبط مع الأدلة التجريبية طndicating أن الأوعية الدموية / الخلايا البطانية والبطين السائل النخاعي (CSF) تشكل مصادر ينظم إشارات القابلة للذوبان التي تعمل على NSCs 2،6،9-11. على السطح البطيني، مثلي النمط والتفاعلات الجانبية apico غيروي التي تنطوي على خلايا البطانة العصبية وB1 تشمل منعطفات ضيقة والملتصقة تقاطعات 5،12. وعلاوة على ذلك، جزيئات الالتصاق المتورطين في المجمعات صلي بين الخلايا B1 و البطانة العصبية، مثل N-كادهيرين وV-CAM، وقد تبين لتنظيم ليس فقط المواقع منظم للغاية من B1 في محراب-V SVZ، ولكن أيضا هدوء من 12 13. تظهر الخلية أحادي الطبقة البطانة العصبية-B1 ليكون بمثابة حاجز نشر السماح للتدفق منظم من الماء وجزيئات صغيرة من السائل النخاعي، ولكن تقييد مرور بين الخلايا البروتينات الكبيرة 10،11. وتشير الأدلة التجريبية أن الخلية B1 هدب قمي في موقع فريد يمكن أن تلعب دورا كجهاز استشعار من الإشارات البروتينية الموجودة في السائل النخاعي 2،5-7. خلايا البطانة العصبية هي، في حد ذاته، وهو أيضا مصدر إشارات قابلة للذوبان وبغشاء التي لها دور في تنظيم السلوك مجلس الأمن القومي 14،15.
نوكليوسدس يمكن تتبعها، مثل برومو deoxyuridine (BrdU)، أو الفيروسات القهقرية وقد استخدمت على نطاق واسع لتسمية الخلايا الاصلية، بما في ذلك NSCs، في الجسم الحي. ومع ذلك، وهذه الأساليب ليست الأمثل لتتبع مصير طويلة الأجل لإشارات BrdU تمييع خلال انقسامات الخلية المتكررة والفيروسات القهقرية يبدو أنها تستهدف بشكل تفضيلي عابر تضخيم الخلايا بسبب احتياجاتهم من تكاثر الخلايا لالتنبيغ 16،17. لدراسة علم وظائف الأعضاء في مجلس الأمن القومي في الجسم الحي، بما في ذلك التفاعل مع المكونات المتخصصة، لا بد من وضع طريقة لتسمية وتعقب خلايا نادرا تقسيم، كما B1-NSCs هي هادئة إلى حد كبير وخلايا البطانة العصبية المجاورة لها أبدا تقسيم في ظل الظروف الفسيولوجية 3. هنا، وتبين لنا أن ناقلات lentiviral (لفس) تسمح للعلامة الجينات ذات الكفاءة العاليةجي والتعديل على المدى الطويل من NSCs الكبار وعدم تقسيم خلايا البطانة العصبية، ويرجع معظم معقول لقدرتها على تنبيغ وعلى الاندماج في جينوم الخلايا المستهدفة بطريقة دورة مستقلة الخلية. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا كيف أن مسار تسليم والفيروسية عيار تساعد على تنبيغ تحديدا خلايا البطانة العصبية، ولكن ليس على الخلايا B1 مما يسمح للتحليل التي تعتمد على محراب، والآثار البطانة العصبية على NSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
لفس توفر مزايا هامة على الأنظمة الفيروسية الأخرى للتعديل الجيني الكبار NSCs 16،18. تسليم التجسيمي من lentiviruses إلى محراب-V SVZ يمثل وسيلة فعالة لتسمية وتتبع نادرا تقسيم B1-NSCs التغلب على القيود المفروضة على غيرها من الأساليب المستخدمة عادة مثل BrdU، التي تضعف بعد الانقساما…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف مساعدة من MJ بالوب والدعم الفني للSCSIE من جامعة دي فالنسيا. كما نشكر أنطونيا Follenzi لتعليقات مفيدة والمناقشة للمخطوطة. إذا كانت مدعومة من قبل مؤسسة بوتين، من خلال بانكو سانتاندر من خلال الشعبة العالمية سانتاندر جامعاتها، ومن المنح المقدمة من كتالونيا VALENCIANA (بروجراما PROMETEO، ACOMP، والتصنيف الصناعي الدولي الموحد) وMINISTERIO دي ECONOMIA ذ Competitividad (MINECO: SAF2011-23331، CIBERNED وRETIC تيرسل) . وأيد هذا العمل أيضا BFU2010-21823 وRETIC تيرسل المنح المقدمة من MINECO ومجلس الأبحاث الأوروبي (ERC) عام 2012 جنيها استرلينيا (260511- PD-HUMMODEL) إلى AC BM-P. وهو حاصل على زمالة FPI الإسبانية من MINECO.
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
References
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
