Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Die Maus-ventrikulären-Subventrikularzone (V-SVZ), in den Wänden des lateralen Ventrikel des Striatum zugewandt ist, ist eine sehr aktive Keimbereich, in dem ein kontinuierlicher Prozess der Vorläuferzellreplikation und Differenzierung ergibt sich die anhaltende Produktion von Riechkolben (OB ) Inter und Corpus callosum Oligodendrozyten ^1. Die lebenslange Erzeugung dieser Zellen wird durch die Anwesenheit in diesem Bereich von neuralen Stammzellen (NSC; auch als B1-Zellen) unterstützt werden, die die astrozytären Antigen glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Stammzellmarker wie Nestin, Id1 auszudrücken und Sox2 ^2. GFAP-exprimierenden B1 Zellen erzeugen Transit Verstärken Vorläufer (TAP) Zellen (C-Zellen), die die Transkription DLX2 auszudrücken Faktoren (distal losen homeobox 2) und ASCL1 (mammalian Achaete-Schute homolog 1) und schnell zu einem mehrmals teilen, bevor sie Anlaß geben zu migrieren Neuroblasten (A-Zellen) oder oligodendroblasts ^3. Neu generierten prolifoperativen Neuroblasten Migration nach vorn, die rostralen Migrationsstrom (RMS) an den OB bildet, wo sie in dem körnigen und glomeruläre Schichten wie differenziert inhibitorischen Inter integrieren. Migrieren von jungen oligodendroblasts zur CC bewegen, wo sie unreif NG2-positive Zellen werden, die lokal oder differenzieren zu reifen myelinisierenden Oligodendrozyten ^1,4 weiter zu unterteilen.

B1-Zellen, die aus fötalen radialen Gliazellen ableiten, behalten die langgestreckte und polarisierte Morphologie ihrer Vorgänger und weisen eine hoch spezialisierte Beziehung zu ihrer Nische. Sie erstrecken sich zwischen dem Ependyms welche Linien der Herzkammer und dem Netzwerk von Blutgefäßen, die die V-SVZ Nische bewässern. Die kleine apikale Prozess der B1-Zellen lagert sich unter multiciliated ependymocytes und endet in einem unbeweglichen primären Zilien, während ihre basalen Prozess lange Strecken erweitert die planare Gefäßplexus zu nähern, die diese Nische Ende in der b bewässertasal Lamina des Plexus Kapillaren ^2,5-8.

Der zuverlässigste Weg B1-NSC aus nicht-neurogenen Astrozyten, die auch GFAP ^+, in der intakten V-SVZ Nische zu unterscheiden, basiert auf ganze Montage Zubereitungen der Ventrikel Seitenwand und deren Analyse durch 3-D konfokale Mikroskopie nach für GFAP Immunfärbung des dünnen B1-NSC apikalen Verfahren, β-Catenin zu beschriften Zellmembranen abzugrenzen, und entweder γ-Tubulin als Marker für cilial Basalkörpern oder acetyliertes α-Tubulin die Ausdehnung jeder cilium ^5,8 zu beschriften. Beobachtungen dieser Ganz Halterungen von der ventrikulären Oberfläche haben gezeigt, dass B1 und Ependymzellen in "pinwheels" ⁵ angeordnet sind, in denen die uniciliated apikale Prozesse eines oder mehrerer GFAP ⁺ B1-Zellen von einer Rosette aus multiciliated Ependymzellen umgeben sind.

Die charakteristische Morphologie von B1-Zellen korreliert mit experimentellen Beweis iRückenmarksflüssigkeit (CSF) bilden geregelt Quellen von löslichen Signale ndicating die Blutgefäße / Endothelzellen und ventrikuläre auf NSCs wirkenden ^2,6,9-11. An der ventrikulären Oberfläche, homotypische und hetero apikal-lateralen Wechselwirkungen zwischen ependymal und B1-Zellen gehören tight junctions und Adhärenzverbindungen ^5,12. Außerdem impliziert Adhäsionsmolekülen in den junctional Komplexen zwischen B1 und Ependymzellen, wie N-Cadherin und V-CAM, wurden in der V-SVZ Nische, sondern auch ihre Ruhe ¹² die hoch organisierten Positionierung von B1 nicht nur gezeigt, zu regulieren ^{, 13.} Die ependymalen-B1 Zellmonoschicht erscheint als eine Diffusionsbarriere zu wirken, um den geregelten Fluss von Wasser und kleinen Molekülen aus der CSF erlaubt, aber den Durchgang von großen interzellulären Proteinen ^10,11 einzuschränken. Experimentelle Daten zeigen, dass die einzigartig positioniert, B1 Zelle apikal Zilien eine Rolle als Sensor von Signalisierungs Polypeptide ² in der CSF spielen ^könnte,7.5. Ependymzellen sind an sich auch eine Quelle von löslichen und membrangebundenen Signale mit einer Rolle bei der Regulation von NSC Verhalten ^14,15.

Rückverfolgbar Nucleoside, wie Brom-desoxyuridin (BrdU) oder Retroviren sind weit zu beschriften Vorläuferzellen, einschließlich NSC, in vivo verwendet. Jedoch sind diese Methoden nicht optimal für die Rückverfolgung langfristige Schicksal weil BrdU Signale durch wiederholte Zellteilungen und Retroviren verdünnen erscheinen vorzugsweise vorübergehend an Zielzellen aufgrund ihrer Erfordernis der Zellproliferation zur Transduktion ^16,17 verstärken. NSC Physiologie in vivo, auch der Wechselwirkungen mit Nischen Komponenten zu untersuchen, ist es entscheidend, ein Verfahren zu etablieren selten teilende Zellen zu kennzeichnen und Spuren, als B1-NSCs weitgehend ruhig sind und deren Nachbar Ependymzellen nie ³ unter physiologischen Bedingungen unterteilen. Hier zeigen wir, dass lentivirale Vektoren (LVs) ermöglichen eine hocheffiziente Gen ZeichenIng und langfristige Änderung der Erwachsenen NSC und nicht teil Ependymzellen aufgrund meisten angemessen ihrer Fähigkeit zu transduzieren und in das Genom der Zielzellen in einer Zellzyklus-unabhängigen Weise zu integrieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Route der Lieferung und virale Titer Hilfe speziell Ependymzellen transduzieren, aber nicht B1-Zellen wodurch die Analyse der Nische abhängig, ependymal Auswirkungen auf NSCs.